Giardia duodenum ir parazitārs organisms, kas izraisa giardiozi, zarnu infekciju, kas īpaši izplatīta maziem bērniem ar klīniskām caurejas pazīmēm.Mēs jau iepriekš ziņojām, ka ārpusšūnu G. duodenalis izraisa intracelulāro oligomerizācijai līdzīgo receptoru 3 (NLRP3) saistošo nukleotīdu aktivāciju un regulē saimnieka iekaisuma reakcijas, izmantojot ārpusšūnu pūslīšu (EV) sekrēciju.Tomēr joprojām ir jānoskaidro precīzi šajā procesā iesaistītā ar patogēnu saistītā duodenokoku EV (GEV) molekulārie modeļi un NLRP3 iekaisuma loma giardiozē.
Tika konstruētas rekombinantās eikariotu ekspresijas plazmīdas pcDNA3.1(+)-alfa-2 un alfa-7.3 giardīni GEV, transfekētas peles primārajos peritoneālajos makrofāgos un konstatētas, mērot iekaisuma mērķa molekulu kaspāzi-1.Tika pārbaudīts p20 ekspresijas līmenis..G. duodenalis alfa-2 un alfa-7.3 giardīnas sākotnēji tika identificētas, mērot NLRP3 iekaisuma (NLRP3, pro-interleikīna-1 beta [IL-1β], pro-kaspāzes-1 un kaspāzes-1 p20), IL sekrēciju.1β līmeņi, apoptotiskā plankumaina proteīna (ASC) oligomerizācijas līmeņi un NLRP3 un ASC imunofluorescējoša lokalizācija.Pēc tam tika novērtēta NLRP3 iekaisuma loma G. duodenalis patogenitātē, izmantojot peles, kurām tika bloķēta NLRP3 aktivācija (NLRP3 bloķētas peles) un tika novērotas patoloģiskās ķermeņa svara izmaiņas, divpadsmitpirkstu zarnas parazītu slodze un divpadsmitpirkstu zarnas audi.Turklāt mēs pētījām, vai hiardīni alfa-2 un alfa-7.3 in vivo inducē IL-1β sekrēciju caur NLRP3 iekaisumu, un noteicām šo molekulu lomu G. duodenalis patogenitātē pelēm.
Alfa-2 un alfa-7.3 giardīni inducē NLRP3 iekaisuma aktivizēšanu in vitro.Tas izraisīja p20 kaspāzes-1 aktivāciju, NLRP3, pro-IL-1β un pro-kaspāzes-1 proteīnu ekspresijas līmeņa paaugstināšanos, ievērojamu IL-1β sekrēcijas palielināšanos, ASA plankumu veidošanos asinsvados. citoplazmu un ASS oligomerizācijas indukciju.NLRP3 iekaisums Dzimumlocekļa zudums pastiprina G. duodenalis patogenitāti pelēm.Pelēm, kas tika ārstētas ar cistām, izmantojot zondi no NLRP3 bloķētām pelēm, bija palielināts trofozoītu skaits un nopietns divpadsmitpirkstu zarnas bārkstiņu bojājums, kam raksturīgas nekrotiskas kriptas ar saraušanos un sazarošanos.In vivo eksperimenti ir parādījuši, ka giardīnas alfa-2 un alfa-7.3 var izraisīt IL-1β sekrēciju caur NLRP3 iekaisumu, un imunizācija ar giardīniem alfa-2 un alfa-7.3 samazināja G. duodenalis patogenitāti pelēm.
Kopumā šī pētījuma rezultāti liecina, ka giardia alfa-2 un alfa-7.3 izraisa saimniekorganisma NLRP3 iekaisuma pastiprināšanos un samazina G. duodenalis infekciozitāti pelēm, kas ir daudzsološi mērķi giardiozes profilaksei.
Giardia duodenum ir ārpusšūnu vienšūņu parazīts, kas dzīvo tievajās zarnās un katru gadu izraisa 280 miljonus giardiazes ar caureju gadījumu, īpaši maziem bērniem jaunattīstības valstīs [1].Cilvēki inficējas, dzerot ūdeni vai pārtiku, kas piesārņota ar M. divpadsmitpirkstu zarnas cistām, kas pēc tam nonāk kuņģī un izdalās ar kuņģa sulu.Giardia divpadsmitpirkstu zarnas trofozoīti pievienojas divpadsmitpirkstu zarnas epitēlijam, izraisot sliktu dūšu, vemšanu, caureju, sāpes vēderā un svara zudumu.Personas ar imūndeficītu un cistisko fibrozi ir uzņēmīgas pret infekcijām.Infekcija var notikt arī ar orālo un anālo seksu [2].Tādas zāles kā metronidazols, tinidazols un nitazoksanīds ir vēlamās divpadsmitpirkstu zarnas infekciju ārstēšanas iespējas [3].Tomēr šīs ķīmijterapijas zāles izraisa nevēlamas blakusparādības, piemēram, sliktu dūšu, kanceroģenēzi un genotoksicitāti [4].Tāpēc ir jāizstrādā efektīvākas stratēģijas, lai novērstu G. duodenalis infekciju.
Iekaisumi ir citozola proteīnu kompleksu klase, kas ir daļa no iedzimtas imūnās atbildes reakcijas, palīdzot aizsargāties pret patogēnu invāziju un mediēt iekaisuma reakcijas [5].Šo iekaisumu vidū ir plaši pētīta nukleotīdus saistošā oligomerizācijas (NOD) receptora 3 (NLRP3) nukleotīdus saistošā oligomerizācijas (NLRP3) nukleotīdus saistošā iekaisuma slimība, jo to var noteikt pēc dažādiem patogēniem/bojājumiem saistītiem molekulāriem modeļiem (PAMP/). DAMP), atpazīst, aktivizē iedzimto imūnsistēmu.un regulē zarnu homeostāzi daudzu iekaisuma slimību gadījumā [6,7,8].Tas sastāv no modeļa atpazīšanas receptora (PRR) NLRP3, adaptera apoptotiskā plankumaina proteīna (ASC) un efektora prokaspāzes-1 vai prokaspāzes-11.NLRP3 iekaisums darbojas kā saimnieks pret patogēnu invāziju, kā novērots Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10] un Leishmania pētījumos.[11], bet ir arī ziņots, ka NLRP3 iekaisuma aktivizēšana ierobežo aizsargājošās imūnās atbildes un pastiprina slimības progresēšanu, piemēram, tārpiem [12].Pamatojoties uz mūsu iepriekšējiem atklājumiem, mēs ziņojām, ka ārpusšūnu G. duodenalis izraisa NLRP3 iekaisuma intracelulāru aktivāciju un modulē saimniekorganisma iekaisuma reakcijas, izdalot ārpusšūnu pūslīšus (EV) [13].Tomēr vēl ir jānosaka NLRP3 iekaisuma loma G. duodenalis infekcijā in vivo.
Sākotnēji žiardīni tika aprakstīti kā G. duodenalis citoskeleta strukturālie komponenti, un tiem ir svarīga loma trofozoītu kustībā un epitēlija šūnu piesaistē tievajās zarnās.Lai labāk pielāgotos videi un palielinātu to patogenitāti, G. duodenalis trophozoites izveidoja unikālu citoskeleta struktūru, kas sastāv no 8 flagellas, 1 ķermeņa vidusdaļas un 1 vēdera diska [14].Giardia duodenum trofozoīti izmanto savu citoskeletu, lai iekļūtu tievās zarnas augšdaļā, īpaši divpadsmitpirkstu zarnā, un pievienotos enterocītiem.Viņi pastāvīgi migrē un pievienojas epitēlija šūnām, izmantojot šūnu metabolismu.Tāpēc pastāv cieša saikne starp to citoskeletu un virulenci.Giardia duodenum specifiskās žiardīnas ir citoskeleta struktūras sastāvdaļas [15], un tās iedala četrās klasēs: α-, β-, γ- un δ-giardīni.α-giardīnu saimē ir 21 loceklis, kuriem visiem ir no kalcija atkarīga spēja saistīt fosfolipīdus [16].Tie arī savieno citoskeletu ar šūnu membrānu.Indivīdiem ar G. duodenalis izraisītu caureju α-giardīni infekcijas laikā ir ļoti izteikti un imūnreaktīvi [17].Heteroloģiskās vakcīnas, kuru pamatā ir Giardia alfa-1, aizsargāja pret giardiozi pelēm un ir potenciāli kandidātantigēni vakcīnas izstrādei [18].Alfa-8 giardīns, kas lokalizēts plazmas membrānā un flagellas, bet ne vēdera diskā, uzlabo G. duodenalis trofozoītu kustīgumu un augšanas ātrumu [19].Alfa-14 giardīns pievienojas mikrotubulu struktūrām uz flagellas un ietekmē G. duodenalis dzīvotspēju [20].Alfa-11 giardīns ir sastopams bagātīgi visā dzīves ciklā, un pārmērīga alfa-11 giardīna ekspresija bojā pašu G. duodenalis [21].Tomēr nav skaidrs, vai alfa-2 giardīns un alfa-7,3 giardīns aizsargā pret G. duodenalis infekciju un to pamatā esošajiem mehānismiem.
Šajā pētījumā rekombinantās eikariotu ekspresijas plazmīdas pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine un pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine tika transfekētas peles primārajos peritoneālajos makrofāgos, lai aktivizētu saimniekorganismu NLRP3.Pēc tam tika pārbaudīti iekaisīgie mērķi.Mēs arī novērtējām NLRP3 iekaisuma lomu G. duodenalis patogenitātē, izpētījām, vai alfa-2 un alfa-7,3 giardīni inducē NLRP3 iekaisuma aktivizēšanu in vivo, un noskaidrojām, ka šīs divas giardīnu lomas patogenitātē. G. duodenalis.Mūsu kopējais mērķis bija izstrādāt daudzsološus mērķus G. duodenalis infekcijas profilaksei.
Savvaļas tipa (WT) C57BL/6 peļu mātītes vecumā no 5 līdz 8 nedēļām tika iegādātas no Liaoning Changsheng Eksperimentālā dzīvnieku centra (Liaoning, Ķīna).Pelēm bija brīva piekļuve ūdenim, tās saņēma sterilizētu pārtiku un tika turētas 12/12 stundu gaismas/tumsas ciklā.Pirms inficēšanās peles saņēma antibiotikas ad libitum dzeramajā ūdenī, kas papildināts ar ampicilīnu (1 mg/ml), vankomicīnu (1 mg/ml) un neomicīnu (1,4 mg/ml) (visas iegādātas no Šanhajas, Ķīnas, mākslīgie organismi) [22 ].].Peles, kuras zaudēja spēju ēst un dzert vairāk nekā 24 stundas un zaudēja ≥ 20% ķermeņa svara, tika humānā veidā eitanāzijas ar dzemdes kakla izmežģījumu.
WB G. duodenalis trofozoīti (American Type Culture Collection, Manassas, ASV) tika papildināti ar 12,5% liellopu augļa serumu (FBS; Every Green, Zhejiang, China) un 0,1% liellopu žulti (Sigma-Aldrich, Sentmisūri, ASV). ).ASV) mikroaerobos apstākļos.Saplūstošie trofozoīti tika savākti uz ledus un pasāžas attiecībā 1:4 turpmākai reprodukcijai.
Giardia divpadsmitpirkstu zarnas cistas tika ierosinātas, kā aprakstīts iepriekš [23], trofozoīti tika novākti logaritmiskā fāzē un pēc tam atšķaidīti ar iekapsulēšanu izraisošu barotni, pH 7,1 (modificēts TYI-S-33) līdz galīgajai koncentrācijai 1 × 106 trofozoīti / ml.žults koncentrācija 0,05% vide).Trofozoīti tika kultivēti anaerobos apstākļos 37 ° C temperatūrā līdz logaritmiskās augšanas fāzei.Mainiet barotni pret cistu izraisošu barotni (pH 7,8; ​​modificēta TYI-S-33 barotne ar 1% žults koncentrāciju) un kultivējiet G. duodenalis 37°C temperatūrā 48–96 stundas, kuru laikā mikroskopā novēroja cistu veidošanos.Pēc tam, kad lielākā daļa trofozoītu tika izraisīti cistu veidošanā, kultūras maisījums tika novākts un atkārtoti suspendēts sterilā dejonizētā ūdenī, lai lizētu atlikušos trofozoītus.Cistas tika skaitītas un uzglabātas 4 ° C temperatūrā turpmākām analīzēm caur kuņģa zondi pelēm.
Giardia ekstracelulārās pūslīši (GEV) tika bagātināti, kā aprakstīts iepriekš [13].Trophozoīti logaritmiskās augšanas fāzē tika atkārtoti suspendēti modificētā TYI-S-33 barotnē, kas sagatavota ar eksosomu noplicinātu FBS (Biological Industries, Beit-Haemek, Izraēla) līdz galīgajai koncentrācijai 1 × 106 parazīti / ml un inkubēti 12 stundas.tika izolēti no kultūras supernatanta, centrifugējot ar ātrumu 2000 g 10 minūtes, 10 000 g 45 minūtes un 100 000 g 60 minūtes.Nogulsnes izšķīdināja fosfātu buferšķīdumā (PBS), kvantitatīvi noteica, izmantojot BCA proteīna testa komplektu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) un uzglabāja -80 ° C temperatūrā vai izmantoja tieši turpmākām analīzēm.
Primārie peles peritoneālie makrofāgi tika sagatavoti, kā aprakstīts iepriekš [24].Īsumā, pelēm (vecumā no 6 līdz 8 nedēļām) injicēja (intraperitoneāli [ip]) ar 2, 5 ml 2, 98% Difco šķidrās tioglikola barotnes (BD, Franklin Lakes, NJ, ASV) un baroja ar 3-4 aukslējām.Makrofāgu suspensija tika savākta no peļu vēdera dobuma pēc eitanāzijas un centrifugēta 3 reizes pie 1000 g 10 minūtes.Savāktās šūnas tika noteiktas ar plūsmas citometriju, izmantojot CD11b marķieri, līdz šūnu tīrība bija> 98%, pēc tam pievienoja 6 bedrīšu šūnu kultūras plāksnēm (4,5 x 106 šūnas/iedobē) un inkubēja ar 10% FBS (Bioindustry) 37 ° C temperatūrā.un 5% CO2.
RNS tika ekstrahēta no 1 × 107 trofozoītiem 1 ml TRIzol reaģenta (Vazyme, Nanjing, Ķīna), genoma DNS tika ekstrahēta no kopējās G. duodenalis RNS, izmantojot MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, Ķīna), un tika sintezēta komplementārā DNS (cDNS). izmantojot MonScript RTIIII Super Mix (Monad) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.
CDS secības informācija mērķa G. duodenalis gēnam tika iegūta no NCBI GenBank.Izmantojiet Primer 5.0, lai katram mērķa gēnam izstrādātu specifiskus bezšuvju klonēšanas primerus.Priekšējais primer (5′-3′) sastāv no trim daļām: secības, kas pārklājas ar linearizētu vektoru pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) un sākuma kodoniem ATG un GNN (ja pirmā bāze nav G).Tas tiek darīts, lai uzlabotu izteiksmes efektivitāti.Turklāt vismaz 16 bp kombinētās bāzes (GC saturs 40–60%/Tm aptuveni 55 °C).Reversais primer (5'-3') sastāv no divām daļām, secības, kas pārklājas ar EcoRV linearizētu vektoru pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) un kombinētās bāzes ar vismaz 16 bp.(izņemot pēdējās divas pieturas).bāzes) kodonu, piemēram, AA vai GA, lai ļautu rekombinantajām plazmīdām izteikt marķētās olbaltumvielas).Praimeru sekvences ir norādītas 1. tabulā, un tās sintezēja Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, Ķīna).
Mērķi tika pastiprināti, izmantojot Pfu DNS polimerāzi (Tiangen, Pekina, Ķīna) vai Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Pekina, Ķīna), izmantojot sagatavotu G. duodenalis cDNS kā veidni.Eikariotu ekspresijas vektora plazmīda pcDNA3.1(+) tika linearizēta ar restrikcijas enzīmu EcoRV un defosforilēta, izmantojot Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Linearizētie pcDNA3.1(+) fragmenti un amplificētie mērķa gēna fragmenti tika attīrīti, izmantojot DNS gēla attīrīšanas komplektu (Tiangen), un kvantitatīvi noteikti, izmantojot Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).pcDNA3.1 (+) fragments un katrs mērķa gēna fragments tika rekombinēti, izmantojot MonClone vienas montāžas klonēšanas maisījumu (Monad Biotech Co., Ltd., Sudžou, Ķīna), un apstiprināti ar DNS sekvencēšanu, izmantojot Comate Bioscience Company Limited (Čančuņa, Ķīna)..
No endotoksīniem brīvas plazmīdas pcDNA3.1(+)-alpha-2 un pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 tika ģenerētas, izmantojot SanPrep endotoksīnu nesaturošu plazmīdu mini komplektu (Sangon Biotech).Koncentrācija tika uzturēta virs 500 ng/µl, lai nodrošinātu, ka EDTA eluēšanas buferšķīdumā netraucē transfekcijas testu.Primārie peles peritoneālie makrofāgi tika kultivēti 6 bedrīšu plāksnēs ar pilnu RPMI 1640 barotni (Biological Industries) 12 stundas, pēc tam šūnas 3 reizes mazgāja siltā PBS, lai noņemtu penicilīnu un streptomicīnu, un pēc tam barotnē, kas papildināta ar pilnu barotni.Endotoksīnu nesaturošās plazmīdas pcDNA3.1(+)-alpha-2 un pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2,5 μg) atšķaida 125 μl Opti-MEM reducētā seruma barotnes (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Pēc tam 5 µl Lipofectamine 2000 transfekcijas reaģenta (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) tika atšķaidīti 125 µl Opti-MEM barotnes ar zemu seruma saturu.Sagatavo liposomu-DNS kompleksus, sajaucot atšķaidīto endotoksīnu nesaturošo plazmīdu ar Lipofectamine 2000 un ļaujot maisījumam 5 minūtes nostāvēties istabas temperatūrā.Pārnes kompleksus atsevišķi uz šūnām katrā iedobē un lēnām samaisa.Pēc 4 stundām šūnu kultūras barotne tika aizstāta ar 2 ml pilnīgas RPMI 1640 barotnes un kultivēšana tika turpināta 24 stundas.Šūnām pievienoja svaigu šūnu kultūras barotni un inkubēja dažādos laika punktos atkarībā no testa dizaina.
Olbaltumvielu paraugi no supernatantiem un šūnu lizātiem tika sagatavoti, kā aprakstīts iepriekš [25].Membrānas pārneses parametri pro-IL-1β, pro-kaspāzes-1, kaspāzes-1 p20, NLRP3, β-aktīnam un His-tag bija 200 mA/90 min.Interleikīnam 1β (IL-1β; R&D Systems, Mineapolisa, Minesota, ASV), kaspazei-1 (p20) (Adipogen, Šveice) un NLRP3 (Adipogen SA, Epalingesa, Šveice) un 1:5000, kas mērķēts uz His tagu, ( Amylet Scientific Uhaņa, Ķīna) un β-aktīns (Proteintech, Uhaņa, Ķīna).
Šķērssaistīšana ar disukcinimīda suberātu (DSS) tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [26].Šūnas 3 reizes mazgāja ar aukstu PBS un pilnībā lizēja ar 27. izmēra adatu 50 µl ASC reakcijas buferšķīdumā (pH 8,0), kas satur 25 mM Na2PO4, 187,5 mM NaCl, 25 mM HEPES un 125 mM NaHCO3.Maisījumu centrifugēja pie 5000 g 3 minūtes un granulu sašuva ar 10 µl DSS (25 mM DMSO) un 40 µl ASC reakcijas buferšķīdumu 30 minūtes 37 °C temperatūrā.Pēc centrifugēšanas pie 5000 g 10 minūtes granulu izšķīdināja šķīdumā, kurā bija 40 µl ASC reakcijas buferšķīduma un 10 µl 6x proteīna iekraušanas buferšķīduma (TransGen, Pekina, Ķīna), un pēc tam šķīdums tika atdzesēts istabas temperatūrā 15 minūtes. min., Pēc tam vāra 10 minūtes.Pēc tam olbaltumvielu paraugi tika pakļauti Western blotēšanai, izmantojot primārās anti-ASC antivielas (Wanleibio, Shenyang, Ķīna) ar atšķaidījuma attiecību 1:500.
Pēc iepriekš aprakstītās procedūras [13] tika savākti šūnu kultūras supernatanti un tika noteikta pro-iekaisuma citokīna IL-1β sekrēcija, izmantojot peles IL-1 Beta ELISA komplektu (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Konvertējiet OD450nm vērtības proteīnu koncentrācijās, izmantojot IL-1β standarta līkni.
Šūnas, kas pārklātas uz pārklājuma stikliem, 3 reizes uzmanīgi nomazgāja siltā PBS, fiksēja audu šūnu fiksatorā (Biosharp, Pekina, Ķīna) 10 minūtes istabas temperatūrā (RT), 0,1% Triton X-Permeabilize 100 ° C temperatūrā (atšķaidīts PBS; Biosharp). ) 20 minūtes istabas temperatūrā un bloķēt 5% liellopu seruma albumīnā (PBS) 2 stundas istabas temperatūrā.Pēc tam šūnas inkubēja nakti 4 °C temperatūrā ar primārajām antivielām pret ASC (atšķaidījums 1:100) vai NLRP3 (atšķaidījums 1:100) un ar Cy3 iezīmētu kazu anti-trušu IgG(H+L) (1:400; EarthOx). , Sanfrancisko, Kalifornija, ASV) vai ar FITC konjugētu kazu anti-peles IgG (1:400; Earthox) nakti 37°C temperatūrā tumsā 1 stundu.Kodolus 5 minūtes iekrāsoja ar Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, Ķīna) un novēroja fluorescences mikroskopā (Olympus Corporation, Tokija, Japāna).
Peles tika sadalītas četrās grupās (n = 7 katrā grupā): (i) ar PBS apstrādāta negatīvās kontroles grupa (tikai PBS; ar zondi 100 µl uz peles PBS, kam seko ikdienas intraperitoneāla injekcija 100 µl uz peles PBS 3 stundas vēlāk)., nepārtraukti 7 dienas);(ii) negatīvās kontroles grupa, kas tika ārstēta ar MCC950 inhibitoru [27] (100 µl/peli ar PBS zondi, 3 stundas vēlāk, 10 mg/kg ķermeņa svara [BW] MCC950 [PBS] tika ievadīts intraperitoneāli katru dienu, ilgums 7 dienas);(iii) G. duodenalis cistu infekcijas grupa (1,5 x 106 cistas uz peli ar zondi, 3 stundas vēlāk, 100 μl/peli PBS intraperitoneāli katru dienu 7 dienas);(iv) G. duodenalis cistu kombinētās infekcijas grupas MCC950 inhibitoru ārstēšanas grupa (1,5 × 106 cistas uz peli ar zondi, 10 mg/kg ķermeņa svara MCC950 intraperitoneāli katru dienu 7 dienas 3 stundas).Katras peles ķermeņa svars tika uzraudzīts katru dienu, un visas peles tika eitanāzijas 7. dienā.Novāktā divpadsmitpirkstu zarnas (3 cm gara) tika sagriezta mazos gabaliņos 1 ml PBS, cistas tika iznīcinātas nakti PBS 4 ° C temperatūrā, un G. duodenalis trophozoites.Hematoksilīna un eozīna (H&E) krāsošanai tika izolēts svaigs divpadsmitpirkstu zarnas (1 cm garš).
Peles tika sadalītas divās grupās: (i) MOCK kontroles grupa un (ii) MCC950 inhibitoru grupa.Katrā grupā tika veiktas piecas apstrādes (n = 7/ārstēšanas grupā): (i) PBS terapijas negatīvās kontroles grupa (tikai PBS; 100 µl/pelei PBS, intramuskulāra (IM) injekcija (tibialis anterior) [28, 29];( ii) pcDNA3.1(+) plazmīdas negatīvās kontroles grupa (100 µg/peles DNS, izmantojot intramuskulāru injekciju (iii) G. duodenalis cistas infekcijas pozitīvā kontroles grupa (1,5 x 106 cistas uz peli, caur zondi) (iv) a); grupa, kas apstrādāta ar plazmīdu pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/peles DNS, intramuskulāras injekcijas veidā), un (v) grupa, kas apstrādāta ar plazmīdu pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/peli). DNS, pēc 12 stundu pasāžas, pelēm MCC950 inhibitoru grupā katru dienu tika intraperitoneāla MCC950 injekcija (10 mg/kg ķermeņa masas) 7 dienas, savukārt pelēm MOCK grupā tika ievadīts vienāds daudzums PBS. Asins paraugi tika ņemti. savākti no acs ābolu pelēm un atstāti uz nakti 4 ° C temperatūrā, izmantojot enzīmu saistītu imūnsorbcijas testu (ELISA) un IL-1β līmeņa mērījumus.
Trīsdesmit piecas peles tika sadalītas piecās grupās (n = 7/grupā).1. grupa bija negatīva kontroles grupa, kas tika ārstēta ar PBS: pelēm intramuskulāri tika ievadīts 100 μl PBS un 3 dienas vēlāk ar zondi.2. grupa ir pozitīvās kontroles grupa, kas inficēta ar G. duodenalis cistām: pelēm tika injicēts 100 μl PBS, un 3 dienas vēlāk 1,5 x 106 cistas uz peli tika ievadītas intragastrāli.Trešā grupa – plazmīdu imunizācija ar pcDNA3.1(+) kombinācijā ar kontroles grupu divpadsmitpirkstu zarnas cistas infekcijai: pelēm perorāli tika ievadītas 100 μg plazmīdas DNS pcDNA3.1(+)(im), 1,5×106 cistas/pele 3 vairākām. dienas.4. un 5. grupa bija rekombinantā pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardīna plazmīda vai pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardīna plazmīda kombinācijā ar G. duodenalis cistu infekciju.Eksperimentālā grupa: peles saņēma 100 µg pcDNA3.1(+)-giardīna plazmīda DNS (im), pēc tam 3 dienas vēlāk ar zondi tika injicētas 1,5 × 106 cistas uz peli.Katras peles ķermeņa svars tika uzraudzīts pēc G. duodenalis cistas ievadīšanas caur cauruli.Svaiga divpadsmitpirkstu zarnas tika savākta parazītu slodzes mērījumiem un HE krāsošanas analīzei.
Histopatoloģiskās izmaiņas tika analizētas saskaņā ar iepriekš publicētu procedūru [30].Svaiga divpadsmitpirkstu zarna tika fiksēta ar audu šūnu fiksatoru, iestrādāta parafīnā, sagriezta 4 μm sekcijās, iekrāsota ar H&E un analizēta gaismas mikroskopā.Reprezentatīvās patoloģiskās izmaiņas septiņās audu sekcijās no septiņām neatkarīgām pelēm novērtēja patologs, kurš nezināja par ārstēšanu, un tās tika fiksētas ar 200x palielinājumu.Villu garums un kriptu dziļums tika mērīts saskaņā ar iepriekš aprakstītajām metodēm.
Rezultāti in vitro un in vivo tika iegūti trīs eksemplāros.Grafiki tika ģenerēti, izmantojot GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, ASV).Atšķirības starp divām grupām tika analizētas ar t-testu, savukārt atšķirības starp ≥3 grupām tika analizētas ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), izmantojot SPSS programmatūru (versija 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, ASV).Dati tika analizēti, lai noteiktu dispersijas viendabīgumu, izmantojot Levēna testu, kam sekoja Bonferroni post hoc tests (B).Nozīmīgums ir izteikts kā P<0,05, P<0,01 un P<0,001 (nav nozīmīgs [ns]) (P>0,05).
Mūsu iepriekšējā GEV proteomikas analīze Kioto gēnu un genomu enciklopēdijā (KEGG) parādīja, ka daudzi mērķi var būt iesaistīti iekaisuma signalizācijas ceļu aktivizēšanā [13].Mēs izvēlējāmies divus daudzsološus mērķus, alfa-2 un alfa-7.3 giardīnus, pastiprinām šīs molekulas un izmantojām tās, lai izveidotu pcDNA3.1(+) eikariotu ekspresijas vektoru.Pēc sekvencēšanas rekombinantās pcDNA3.1(+)-alfa-2 un alfa-7.3 giardīna ekspresijas plazmīdas tika transfekētas primārajos peles peritoneālajos makrofāgos, un tika identificēts kaspazes-1 p20 iekaisuma paraksta proteīns (aktivētās kaspāzes-1 fragments). kā izskaidrot galvenās molekulas, kas var izraisīt iekaisumu.Rezultāti parādīja, ka alfa-2 un alfa-7.3 giardīni var izraisīt p20 kaspāzes-1 ekspresiju, kas ir līdzīga GEV.Ietekme uz kaspāzes-1 aktivāciju netika konstatēta neapstrādātajā negatīvajā kontrolē (tikai PBS) un plazmīdas kontroles pcDNA3.1(+) (1. attēls).
P20 kaspāzes-1 aktivācijas mērīšana ar pcDNA3.1(+)-alfa-2 un alfa-7.3 giardīniem.Rekombinantās eikariotu ekspresijas plazmīdas pcDNA3.1(+)-alpha-2 un alfa-7.3 giardīnas (virs katras joslas) tika transfekētas primārajos peles peritoneālos makrofāgos un kultūras supernatanti tika savākti 24 stundas vēlāk.Western blotēšana tika izmantota, lai izmērītu paraksta kaspāzes-1 p20 iekaisuma proteīna ekspresijas līmeni.Tikai PBS ārstēšanas grupa (C josla) un pcDNA3.1(+) monoterapijas grupa (pcDNA3.1 josla) tika izmantota kā negatīva kontrole, un GEV terapijas grupa tika izmantota kā pozitīva kontrole.Rekombinantā proteīna ekspresija tika apstiprināta, nosakot histidīna marķējumu katrā proteīnā, un paredzamās proteīna joslas bija alfa-2 giardīns (38, 2 kDa) un alfa-7, 3 giardīns (37, 2 kDa).GEV, Giardia divpadsmitpirkstu zarnas ekstracelulārie pūslīši, pcDNA3.1(+), EcoRV linearizēts vektors, SUP, supernatants
Lai noteiktu, vai alfa-2 giardīns un alfa-7.3 giardīns inducē p20 kaspāzes-1 ekspresiju un spēlē lomu saimnieka NLRP3 iekaisuma reakcijas aktivizēšanā, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardīns un pcDNA3.1(+)-alfa -7,3 giardīns tika transficēts primārajos peles peritoneālos makrofāgos ar rekombinanto plazmīdu DNS, un tika noteikti galveno iekaisuma proteīnu NLRP3 ekspresijas, lokalizācijas un oligomerizācijas līmeņi.Šajā eksperimentā GEV tika izmantota kā pozitīvā kontroles grupa, un grupa bez apstrādes (tikai PBS) vai pcDNA3.1(+) transfekcijas terapijas grupa bija negatīvā grupa.Rezultāti parādīja, ka, tāpat kā GEV grupā, giardīna pcDNA3.1(+)-alfa-2 un giardīna pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 rekombinantā plazmīda DNS izraisīja NLRP3, pro-IL-1β un prokaspāzes-1 un kaspāzes-1 aktivācija (2.a att.).Turklāt abas žiardīnas izraisīja nozīmīgu IL-1β sekrēciju (pcDNA3.1: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,1000; alfa-2 giardīns: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0007 ).;alfa-7,3 žiardīns: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P<0,0001;GEV: ANOVA, F(4, 10) = 1,625, P = 0,0047) (2.b attēls).Lielākā daļa ASC proteīnu bija monomēri grupā bez ārstēšanas vai ārstēšanas grupā, kas tika transficēta ar pcDNA3.1(+) plazmīdu, atšķirībā no pcDNA3.1(+)-alpha-2 vai pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 žiardīna.ASC oligomerizācija notika GEV pozitīvās kontroles grupas vai grupas rekombinantajā plazmīdas DNS, parādot oligomēru formu (2.c attēls).Šie provizoriskie dati liecina, ka alfa-2 giardīns un alfa-7, 3 giardīns var izraisīt NLRP3 iekaisuma aktivāciju.Turpmākie imunofluorescējošie ASC un NLRP3 lokalizācijas pētījumi parādīja, ka negatīvās kontroles grupā ASC proteīns bija izkliedēts visā citoplazmā un parādījās kā punktveida signāls, stimulējot pcDNA3.1(+)-alfa-2 ar žiardīnu vai pcDNA3.1(+)-alfa-7,3 giardīna grupa vai GEV pozitīvās kontroles grupa (2.d attēls).Negatīvās kontroles un ar plazmīdu apstrādātās pcDNA 3.1 grupās NLRP3 proteīna signāls netika atklāts, bet fluorescējoša signāla punkts, reaģējot uz pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardīnu vai pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 tika atklāts..giardīns ir atrodami citoplazmā vai pēc HEV stimulēšanas (2.e attēls).Šie dati arī parāda, ka G. duodenalis giardin alfa-2 un giardin alfa-7.3 aktivizē NLRP3 iekaisumu peles primārajos peritoneālās makrofāgos.
pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardīns un pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardīns aktivizē NLRP3 iekaisumu peles peritoneālās makrofāgos.Transfektējiet rekombinantās eikariotu ekspresijas plazmīdas pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardin un pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin primārajos peļu peritoneālās makrofāgos un šūnās vai savāciet supernatantu 24 stundu laikā ekspresijas analīzei, oligomerizācijai. , sekrēts.un galveno iekaisuma proteīnu lokalizācija.Tikai PBS (C) grupa un pcDNA3.1(+) viena apstrādes grupa tika izmantota kā negatīva kontrole, un GEV terapijas grupa tika izmantota kā pozitīvā grupa.Galvenie iekaisuma proteīni NLRP3, tostarp NLRP3, pro-IL-1β, pro-kaspāze-1 un p20 kaspāze-1, tika atklāti ar Western blotēšanu.b IL-1β sekrēcijas līmeņi supernatantos tika noteikti, izmantojot ar enzīmu saistīto imūnsorbcijas testu (ELISA).Atšķirības starp kontroles un eksperimentālajām grupām tika analizētas ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), izmantojot SPSS programmatūras versiju 22.0.Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām starp grupām **P<0,01 un ***P<0,001.c ASC oligomerizācijas līmeņi granulās tika noteikti ar DSS šķērssaistīšanas analīzi, savukārt ASC līmeņi šūnu lizātos tika izmantoti kā slodzes kontrole.d ISC lokalizācijas vizualizācija, izmantojot imunofluorescenci.e Imunofluorescence tika izmantota, lai vizualizētu NLRP3 lokalizāciju.ASC, apoptotiskiem plankumiem līdzīgs proteīns;IL, interleikīns;NLRP3, nukleotīdu saistošais oligomerizācijai līdzīgs receptors 3;ns, nav nozīmīgs (P > 0,05)
Gan G. duodenalis, gan tā izdalītie GEV aktivizē NLRP3 iekaisuma procesu un regulē saimnieka iekaisuma reakcijas in vitro.Tādējādi NLRP3 iekaisuma loma G. duodenalis patogenitātē joprojām nav skaidra.Lai izpētītu šo problēmu, mēs izstrādājām eksperimentu starp pelēm, kas inficētas ar G. duodenalis cistu, un pelēm, kas inficētas ar G. duodenalis cistu + MCC950 inhibitoru ārstēšanu, un salīdzinājām NLRP3 iekaisuma izpausmi, kad tās bija inficētas ar G. duodenalis cistu.Detalizēta eksperimenta shēma ir parādīta 3.a attēlā.Peļu ķermeņa masas izmaiņas dažādās ārstēšanas grupās tika novērotas 7 dienas pēc inficēšanās ar cistām, un rezultāti parādīti 3.b attēlā.Salīdzinot ar grupu, kas tika ārstēta ar tīru PBS, rezultāti parādīja, ka (i) ar G. duodenalis cistu inficēto peļu ķermeņa masa samazinājās no 3. līdz 7. dienai pēc inficēšanās;(ii) ārstēšana ar MCC950 inhibitoru būtiski neietekmēja peļu ķermeņa svaru..Salīdzinot ar vienas infekcijas grupu, ar MCC950 ārstētās divpadsmitpirkstu zarnas infekcijas grupas ķermeņa masas samazināšanās dažādās pakāpēs (1. diena: ANOVA, F(3, 24) = 1,885, P = 0,0148; 2. diena: ANOVA, F( 3, 24) ) = 0,4602, P<0,0001 3. diena: ANOVA, F(3, 24) = 0,8360, P = 0,0010: ANOVA, F(3, 24) = 1,683, P = 0,0052, 5. diena (3, 24) = 0,6497, P = 0,0645; 6. diena: ANOVA, F(3, 24) = 5,457, P = 0,0175; 7. diena: ANOVA, F(3, 24) = 2,893, P = 0,0202.Šie dati liecina, ka NLRP3 iekaisums aizsargā peles no ievērojama svara zuduma divpadsmitpirkstu zarnas infekcijas agrīnā stadijā (2–4 dienas).Pēc tam mūsu mērķis bija noteikt G. duodenalis trofozoītus divpadsmitpirkstu zarnas skalošanas šķidrumā, un rezultāti ir parādīti 3.c attēlā.Salīdzinot ar G. duodenalis cistu infekcijas grupu, trofozoītu skaits divpadsmitpirkstu zarnā ievērojami palielinājās pēc NLRP3 iekaisuma bloķēšanas (t(12) = 2,902, P = 0,0133).Divpadsmitpirkstu zarnas audi, kas krāsoti ar HE, parādīja, salīdzinot ar negatīvo kontroli, kas tika ārstēta tikai ar PBS un MCC950: (i) G. duodenalis cistas infekcija izraisīja divpadsmitpirkstu zarnas bārkstiņu bojājumu (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0488 ) un kriptu atrofija (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0,0089);(ii) divpadsmitpirkstu zarnas no pelēm, kas inficētas ar G. duodenalis cistām un apstrādātas ar MCC950 inhibitoriem.divpadsmitpirkstu zarnas bārkstiņas bija bojātas un mirušas (ANOVA, F(3, 24) = 0,4903, P = 0,0144) ar atrofiju un kriptu atzarojumu (ANOVA, F(3, 24) = 0,4716, P = 0, 0481) (3.d att. f) .Šie rezultāti liecina, ka NLRP3 iekaisumam ir nozīme G. duodenalis patogenitātes samazināšanā.
NLRP3 iekaisuma loma Giardia divpadsmitpirkstu zarnas infekcijā.Peles tika ievadītas ar zondi (iv) ar duodenokoku cistām un pēc tam apstrādātas ar vai bez MCC950 (ip).Kā kontroles tika izmantotas atsevišķas apstrādes grupas ar PBS vai MCC950.Eksperimentālā grupa un ārstēšanas režīms.b Peļu ķermeņa svars katrā no dažādajām ārstēšanas grupām tika uzraudzīts 7 dienas.Atšķirība starp G. duodenalis infekcijas grupu un G. duodenalis + MCC950 infekcijas ārstēšanas grupu tika analizēta ar t-testu, izmantojot SPSS programmatūras versiju 22.0.Zvaigznītes norāda būtiskas atšķirības pie *P<0,05, **P<0,01 vai ***P<0,001.c Parazītu slodze tika noteikta, saskaitot trofozoītu skaitu divpadsmitpirkstu zarnas skalošanas šķidrumā.Atšķirība starp G. duodenalis infekcijas grupu un G. duodenalis + MCC950 infekcijas ārstēšanas grupu tika analizēta ar t-testu, izmantojot SPSS programmatūras versiju 22.0.Zvaigznītes norāda būtiskas atšķirības pie *P < 0,05.d Hematoksilīna un eozīna (H&E) krāsošanas rezultāti divpadsmitpirkstu zarnas histopatoloģijā.Sarkanās bultiņas norāda uz bārkstiņu bojājumiem, zaļās bultiņas norāda uz kriptu bojājumiem.Mēroga josla: 100 µm.e, f Divpadsmitpirkstu zarnas bārkstiņu augstuma un peles kripta augstuma statistiskā analīze.Zvaigznītes norāda būtiskas atšķirības pie *P<0,05 un **P<0,01.Rezultāti ir ņemti no 7 neatkarīgiem bioloģiskiem eksperimentiem.BW, ķermeņa svars;ig, intragastrālās piegādes ceļš;ip, intraperitoneāls piegādes ceļš;ns, nav būtiski (P > 0,05);PBS, fosfātu buferšķīdums;WT, savvaļas tips
IL-1β sekrēcija ir iekaisuma aktivācijas pazīme.Lai noteiktu, vai G. duodenalis alfa-2 giardīns un alfa-7.3 giardīns aktivizē NLRP3 saimnieka iekaisumu in vivo, mēs izmantojām neārstētas WT peles (fiktīva grupa) un NLRP3 iekaisuma bloķētas peles (MCC950 inhibētā terapijas grupa).Detalizēta eksperimenta shēma ir parādīta 4.a attēlā.Eksperimentālās grupas sastāvēja no pelēm, kas tika ārstētas ar PBS, G. duodenalis cistas tika ārstētas ar zondi, intramuskulāra pcDNA3.1 injekcija un pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardīna vai pcDNA3.1-alfa-7.3 giardīna intramuskulāra injekcija.Septītajā dienā pēc rekombinantās plazmīdas intramuskulāras ievadīšanas tika savākts serums un noteikts IL-1β līmenis katrā grupā.Kā parādīts 4.b attēlā, MOCK grupā: (i) salīdzinot ar PBS grupu, pcDNA3.1 apstrādei nebija būtiskas ietekmes uz IL-1β sekrēciju (ANOVA, F(4.29)=4.062, P=0.9998), tomēr IL-β sekrēcija bija ievērojami paaugstināta G. duodenalis cistu grupā (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine un pcDNA3.1- Alfa-7,3 giardīna intramuskulāra injekcija būtiski palielināja IL-1β līmeni serumā (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P<0,0001);(iii) pcDNA3.1-alfa-7,3 giardīns izraisīja augstu IL-1β sekrēcijas līmeni pcDNA3.1-alfa-2 giardīna intramuskulāras injekcijas grupā (ANOVA, F(4, 29) = 4,062, P = 0,0333) .Salīdzinot ar katru grupu MCC950 ārstēšanas grupā un MOCK grupā: (i) IL-1β sekrēcijas līmenis PBS kontroles grupā un pcDNA3.1 kontroles grupā pēc MCC950 inhibitora bloķēšanas zināmā mērā samazinājās, bet atšķirība nebija. nozīmīgs (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3,540, P = 0,4912 pcDNA3,1: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,5949);(ii) pēc MCC950 bloķēšanas., IL-1β sekrēcija bija ievērojami samazināta ar G. duodenalis cistu inficētajā grupā, pcDNA3.1-alfa-2 giardīna grupā un pcDNA3.1-alfa-7.3 giardīna grupā (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3,540, P = 0,0120 pcDNA3,1-alfa-2 giardīns: ANOVA, F(9, 58) = 3,540, P = 0,0447 pcDNA3,1-alfa-7,3 giardīns (9, ANOVA5,8); ) = 3,540, P = 0,0164).Šie rezultāti liecina, ka alfa-2 giardīns un alfa-7.3 giardīns veicina NLRP3 iekaisuma aktivizēšanu in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardīnas aktivizē NLRP3 saimnieka iekaisumu in vivo.Peles tika imunizētas (IM) ar rekombinanto eikariotu ekspresijas plazmīdu pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine vai pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine un pēc tam apstrādātas ar MCC950 (ip; MCC950 grupa) vai ne (fiktīva grupa). ).PBS vai pcDNA3.1(+) plazmīdu apstrādes grupa tika izmantota kā negatīva kontrole, G. duodenalis cistas ārstēšanas grupa tika izmantota kā pozitīvā kontrole.Eksperimentālā grupa un ārstēšanas režīms.b IL-1β līmenis serumā pelēm tika noteikts 7. dienā ar ELISA testu.Atšķirības starp grupām MOCK grupā tika analizētas, izmantojot vienvirziena ANOVA, un atšķirības starp MOCK grupu un MCC950 grupu tika analizētas, izmantojot SPSS programmatūras versijas 22.0 t-testu.Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām starp ārstēšanas grupām MOCK grupā, *P<0,05 un ***P<0,001;dolāra zīmes ($) norāda uz būtiskām atšķirībām starp katru grupu MOCK grupā un MCC950 grupā pie P<0,05.Septiņu neatkarīgu bioloģisko eksperimentu rezultāti.i, intramuskulāra injekcija, ns, nav nozīmīga (P > 0,05)
Lai izpētītu alfa-2 un alfa-7.3 giardīna mediētās NLRP3 saimnieka iekaisuma aktivācijas ietekmi uz G. duodenalis infekciozitāti, mēs izmantojām WT C57BL/6 peles un injicējām alfa-2 giardīnu un alfa-7.3 giardīnu.plazmīda tika ievadīta intramuskulāri, pēc 3 dienām caur G. duodenalis cistas kuņģa caurulīti, pēc tam peles tika novērotas 7 dienas.Detalizēta eksperimenta shēma ir parādīta 5.a attēlā.Katras peles ķermeņa svars tika mērīts katru dienu, svaigu divpadsmitpirkstu zarnas audu paraugi tika savākti 7. dienā pēc ievadīšanas caur kuņģa zondi, tika mērīts trofozoītu skaits un novērotas histopatoloģiskas izmaiņas.Kā parādīts 5.b attēlā, palielinoties barošanas laikam, peļu ķermeņa masa katrā grupā pakāpeniski palielinājās.Peļu MT sāka samazināties 3. dienā pēc G. duodenalis cistu intragastrālās ievadīšanas, un pēc tam pakāpeniski palielinājās.NLRP3 iekaisuma aktivizēšana, ko izraisīja alfa-2 giardīna un alfa7.3 giardīna intramuskulāra injekcija, ievērojami mazināja svara zudumu pelēm (1. diena: pcDNA3.1-alfa-2 giardīns, ANOVA, F(4, 30) = 1,399, P = 0,9754 1. diena: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardīns, ANOVA, F(4, 30)=1,399, P=0,9987 2. diena: pcDNA3.1-alfa-2 giardīns, ANOVA, F( 4, 30) = 0,3172, P = 0,9979 2. diena: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardīns, ANOVA, F(4, 30) = 0,3172, P = 0,8409 3. diena: pcDNA3.1-alfa-2 ANOVA, F,; 4, 30) = 0,8222, P = 0,0262 3. diena: pcDNA3,1-alfa-7,3 giardīns, ANOVA, F(4, 30) = 0,8222, P = 0,0083 4. diena: pcDNA3.1-alfa-2VAgiine , F(4, 30) = 0,5620, P = 0,0012, 4. diena: pcDNA3.1-alfa-7.3 giardīns, ANOVA, F(4, 30) = 0,5620, P < 0,0001, 5. diena: pcDNA3.1-alpha 2 giardīns, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 5. diena: pcDNA3.1-alfa -7.3 giardīns, ANOVA, F(4, 30) = 0,9728, P < 0,0001 6. diena: .1 -DNA alfa-2 giardīns, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0012, 6. diena: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardīns, ANOVA, F(4, 30) = 0,7154, P = 0,0006;7. diena: pcDNA3.1-alfa-2 giardīns, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P<0,0001 7. diena: pcDNA3.1-alfa-7,3 giardīns, ANOVA, F(4, 30) = 0,5369, P <0,0001).Parazītu slodze tika novērtēta divpadsmitpirkstu zarnā (5.c att.).Salīdzinot ar neapstrādātu pozitīvo kontroli un grupu, kurā tika injicēts tukšs pcDNA3.1 vektors, G. duodenalis trofozoītu skaits bija ievērojami samazināts grupās, kurām tika injicēts α-2 giardīns un α-7,3 giardīns (pcDNA3.1-alfa). -2 giardīns : ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0002, pcDNA3.1-alfa-7,3 giardīns: ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P<0,0001).Turklāt giardīns alfa-7,3 bija vairāk aizsargājošs pelēm nekā giardīns alfa-2 (ANOVA, F(3, 24) = 1,209, P = 0,0081).HE krāsošanas rezultāti ir parādīti attēlā.5d–f.Pelēm, kurām tika injicēts alfa-2 giardīns un alfa-7.3 giardīns, bija mazāk divpadsmitpirkstu zarnas audu bojājumu, kas izpaudās ar bārkstiņu bojājumiem, salīdzinot ar pelēm, kurām tika injicēts G. duodenalis, un pelēm, kurām tika injicēts G. duodenalis kombinācijā ar tukšu pcDNA3 vektoru .1 Zoom.(pcDNA3.1-alfa-2 giardīns: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0035 vai P = 0,0068; pcDNA3.1-alfa-7,3 giardīns: ANOVA, F(3, 24) = 2,466, P = 0,0028 vai P = 0,0055) un samazināta kripta atrofija (pcDNA3.1-alfa-2 giardīns: ANOVA, F(3, 24) = 1,470, P = 0,0264 vai P = 0,0158; pcDNA3.1-alfa-7,3 ANOVAgiardīns: , F(3, 24) = 1,470, P = 0,0371 vai P = 0,0191).Šie rezultāti liecina, ka alfa-2 giardīns un alfa-7,3 giardīns samazina G. duodenalis infekciozitāti, aktivizējot NLRP3 iekaisuma izraisītāju in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardīnu loma G. duodenalis infekcijā.Peles tika imunizētas (IM) ar rekombinantām eikariotu ekspresijas plazmīdām pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardine vai pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine un pēc tam tika pakļautas G. duodenalis cistām (ig).PBS grupa un pcDNA3.1(+) + divpadsmitpirkstu zarnas cistas ārstēšanas grupa tika izmantota kā negatīvas kontroles grupas, un divpadsmitpirkstu zarnas cistas ārstēšanas grupa tika izmantota kā pozitīvās kontroles grupa.Eksperimentālā grupa un ārstēšanas režīms.b Peļu MT katrā no dažādajām ārstēšanas grupām tika uzraudzīta 7 dienas pēc inficēšanās.Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām starp grupām G. duodenalis grupā un pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardīna grupā, *P < 0,05, **P < 0,01 un ***P < 0,001;dolāra zīme ($) norāda uz būtisku atšķirību starp katru G. duodenalis grupu un pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine grupu, $$P<0.01 un $$$P<0.001.c Parazītu slodze tika noteikta, saskaitot trofozoītu skaitu 1 ml divpadsmitpirkstu zarnas skalošanas no divpadsmitpirkstu zarnas (3 cm garumā), un izteica kā parazītu skaitu uz divpadsmitpirkstu zarnas cm.Atšķirības starp G. duodenalis infekcijas grupu, pcDNA3.1(+)-alfa-2 giardīna grupu un pcDNA3.1(+)-alfa-7.3 giardīna grupu tika analizētas ar vienvirziena ANOVA, izmantojot SPSS programmatūras versiju 22.0.Zvaigznītes norāda būtiskas atšķirības pie **P<0,01 un ***P<0,001.d Histopatoloģiskas izmaiņas divpadsmitpirkstu zarnā.Sarkanās bultiņas norāda uz bārkstiņu bojājumiem, zaļās bultiņas norāda uz kriptu bojājumiem.Mēroga josla: 100 µm.e, f Peļu divpadsmitpirkstu zarnas bārkstiņu augstuma (e) un kripta augstuma (f) statistiskā analīze.Atšķirības starp grupām 1.d attēlā tika analizētas ar vienvirziena ANOVA, izmantojot SPSS programmatūras versiju 22.0.Zvaigznītes norāda būtiskas atšķirības pie *P<0,05 un **P<0,01.Septiņu neatkarīgu bioloģisko eksperimentu rezultāti.ns, nav nozīmīgs (P > 0,05)
Giardia duodenum ir labi zināms cilvēku un citu zīdītāju zarnu parazīts, kas izraisa giardiozi.2004. gadā tas tika iekļauts PVO novārtā atstāto slimību iniciatīvā, jo tā bija augsta izplatība 6 gadu laikā, īpaši kopienās ar zemu sociālekonomisko stāvokli [32].Iedzimtajai imūnsistēmai ir izšķiroša nozīme imūnreakcijā pret G. duodenalis infekciju.Ir ziņots, ka peļu makrofāgi aprij un nogalina G. duodenalis, atbrīvojot ārpusšūnu slazdus [33].Mūsu iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka G. duodenalis, neinvazīvs ārpusšūnu parazīts, aktivizē p38 MAPK, ERK, NF-κB p65 un NLRP3 iekaisuma signālu ceļus peles makrofāgos, lai regulētu saimnieka iekaisuma reakcijas, un atbrīvotais GEV var uzlabot šo procesu.13], 24].Tomēr vēl ir jānoskaidro precīzi PAMP, kas iesaistīti NLRP3 iekaisuma regulētā iekaisumā GEV un NLRP3 iekaisuma loma giardiazē.Lai noskaidrotu šos divus jautājumus, mēs veicām šo pētījumu.
NLRP3 inflammasome atrodas imūno šūnu citoplazmā, un to var aktivizēt dažādas daļiņas, piemēram, urīnskābes kristāli, toksīni, baktērijas, vīrusi un parazīti.Baktēriju pētījumos toksīni ir identificēti kā galvenie PAMP, kas aktivizē iekaisuma sensorus, izraisot iekaisumu un šūnu nāvi [34].Daži strukturāli dažādi toksīni, piemēram, hemolizīns no Staphylococcus aureus [35] un Escherichia coli [36], hemolizīns BL (HBL) no enterotoksīna (NHE) [37], izraisa NLRP3 iekaisuma aktivizēšanos.Vīrusu pētījumi ir parādījuši, ka virulences proteīni, piemēram, SARS-COV-2 apvalka (E) proteīns [38] un Zika vīrusa NS5 proteīns [39], ir svarīgi PAMP, ko atpazīst NLRP3 receptors.Parazītu pētījumos ir ziņots, ka daudzi parazīti ir saistīti ar saimnieka iekaisuma aktivāciju, piemēram, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] un Leishmania [42].Blīvās granulu proteīni GRA35, GRA42 un GRA43, kas saistīti ar Toxoplasma gondii virulenci, ir nepieciešami piroptozes ierosināšanai Lūisa žurku makrofāgos [43].Turklāt daži Leishmania pētījumi ir vērsti uz atsevišķām molekulām, kas iesaistītas NLRP3 iekaisumā, piemēram, parazītu membrānas lipofosfoglikānu [44] vai cinka metaloproteāzi [45].Ir pierādīts, ka starp aneksīnam līdzīgo alfa-giardīnu gēnu saimi alfa-1 giardīns ir potenciāls vakcīnas kandidāts, kas nodrošina aizsardzību pret G. duodenalis peles modelī [18].Mūsu pētījumā mēs izvēlējāmies G. duodenalis virulences faktorus alfa-2 un alfa-7,3 giardīnas, kas ir unikāli giardijai, bet par kuriem ziņots salīdzinoši mazāk.Šie divi mērķa gēni tika klonēti pcDNA3.1(+) eikariotu ekspresijas sistēmas vektorā, lai analizētu iekaisuma aktivāciju.
Mūsu peles modelī šķeltie kaspāzes fragmenti kalpo kā iekaisuma aktivācijas marķieri.Pēc stimulācijas NLRP3 mijiedarbojas ar ASC, pieņem darbā procaspāzes un ģenerē aktīvās kaspāzes, kas sašķeļ pro-IL-1β un pro-IL-18 nobriedušā IL-1β un IL-18, attiecīgi -18.Iekaisuma kaspāzes (kaspāzes-1, -4, -5 un -11) ir konservēta cisteīna proteāžu saime, kas ir būtiska iedzimtai aizsardzībai un ir iesaistīta iekaisumā un ieprogrammētā šūnu nāvē [46].Kaspāzi-1 aktivizē kanoniski iekaisumi [47], savukārt kaspāzes-4, -5 un -11 tiek šķeltas netipisku iekaisumu veidošanās laikā [48].Šajā pētījumā mēs izmantojām peles peritoneālos makrofāgus kā modeli un pētījām p20 kaspāzes-1 šķelto kaspāzi-1 kā saimniekorganisma NLRP3 iekaisuma aktivācijas marķieri G. duodenalis infekcijas pētījumos.Rezultāti parādīja, ka daudzi alfa-giardīni ir atbildīgi par tipisku iekaisuma aktivizēšanu, kas atbilst galveno virulences molekulu atklāšanai, kas iesaistītas baktērijās un vīrusos.Tomēr mūsu pētījums ir tikai provizorisks pētījums, un ir arī citas molekulas, kas var aktivizēt neklasiskus iekaisumus, jo mūsu iepriekšējā pētījumā G. duodenalis infekcijā tika atklāti gan klasiski, gan neklasiski iekaisumi [13].Lai vēl vairāk noteiktu, vai radītā p20 kaspāze-1 ir saistīta ar NLRP3 iekaisumu, mēs transfektējām alfa-2 un alfa-7.3 giardīnus peles peritoneālās makrofāgos, lai noteiktu galvenos molekulu proteīna ekspresijas līmeņus un ASC oligomerizācijas līmeņus, apstiprinot, ka abi α-giardīni aktivizējas. iekaisīgs NLRP3.Mūsu rezultāti nedaudz atšķiras no Manko-Prykhoda et al. rezultātiem, kuri ziņoja, ka Caco-2 šūnu stimulēšana tikai ar G. muris vai E. coli EPEC celmiem var palielināt NLRP3, ASC un kaspāzes-1 fluorescences intensitāti. lai gan ne būtiski, bet kā G. muris un E. coli kostimulācija palielināja trīs proteīnu līmeni [49].Šī neatbilstība var būt saistīta ar atšķirībām Giardia sugu, šūnu līniju un primāro šūnu atlasē.Mēs veicām arī in vivo testus, izmantojot MCC950 5 nedēļas vecām WT C57BL/6 peļu mātītēm, kuras ir jutīgākas pret G. duodenalis.MCC950 ir spēcīgs un selektīvs mazu molekulu NLRP3 inhibitors, kas bloķē kanonisku un nekanonisku NLRP3 aktivāciju nanomolārās koncentrācijās.MCC950 inhibē NLRP3 aktivāciju, bet neietekmē AIM2, NLRC4 un NLRP1 iekaisuma ceļu vai TLR signalizācijas ceļu aktivizēšanu [27].MCC950 bloķē NLRP3 aktivāciju, bet neinhibē NLRP3 ierosināšanu, K+ izplūdi, Ca2+ pieplūdumu vai mijiedarbību starp NLRP3 un ASC;tā vietā tas kavē NLRP3 iekaisuma aktivāciju, bloķējot ASC oligomerizāciju [27].Tāpēc mēs izmantojām MCC950 in vivo pētījumā, lai noteiktu NLRP3 iekaisuma lomu pēc žiardīna injekcijas.Aktivētā kaspāze-1 p10 sašķeļ pro-iekaisuma citokīnus pro-IL-1β un pro-IL-18 par nobriedušu IL-1β un IL-18 [50].Šajā pētījumā IL-1β līmenis serumā ar žiardīnu ārstētām pelēm ar vai bez MCC950 tika izmantots kā indikators tam, vai tika aktivizēts NLRP3 iekaisuma process.Kā gaidīts, ārstēšana ar MCC950 ievērojami samazināja IL-1β līmeni serumā.Šie dati skaidri parāda, ka G. duodenalis giardin alfa-2 un giardin alfa-7.3 spēj aktivizēt NLRP3 peles iekaisumu.
Nozīmīgi dati, kas uzkrāti pēdējo desmit gadu laikā, ir parādījuši, ka IL-17A ir galvenais imunitātes pret G. muris regulators, inducējot IL-17RA signālu pārraidi, ražojot pretmikrobu peptīdus un regulējot komplementa aktivāciju [51].Tomēr Giardia infekcija biežāk sastopama jauniem pieaugušajiem, un ir ziņots, ka Giardia infekcija jaunām pelēm neaktivizē IL-17A reakciju, lai iedarbotos tā aizsargājoša iedarbība [52], mudinot pētniekus meklēt citu imūnmodulējošu Giardia.helmintu infekcijas mehānismi.Nesenā pētījuma autori ziņoja, ka G. muris var aktivizēt NLRP3 iekaisumu ar E. coli EPEC, kas veicina pretmikrobu peptīdu veidošanos un samazina tā piesaistes spēju un trofozoītu skaitu zarnu traktā, tādējādi samazinot resnās zarnas smagumu. baciļu izraisītas slimības [49].NLRP3 iekaisuma process ir iesaistīts dažādu slimību attīstībā.Pētījumi liecina, ka Pseudomonas aeruginosa izraisa autofagiju makrofāgos, lai izvairītos no šūnu nāves, un šis process ir atkarīgs no NLRP3 iekaisuma aktivācijas [53].Attiecībā uz N. caninum reaktīvo skābekļa sugu mediētā NLRP3 iekaisuma aktivācija ierobežo tās replikāciju saimniekorganismā, padarot to par potenciālu terapeitisku mērķi [9].Ir konstatēts, ka Paracoccidioides brasiliensis inducē NLRP3 iekaisuma aktivāciju peles kaulu smadzenēs iegūtajās dendrītiskajās šūnās, kā rezultātā izdalās iekaisuma citokīns IL-1β, kam ir izšķiroša loma saimnieka aizsardzībā [10].Vairākas Leishmania sugas, tostarp L. amazonensis, L. major, L. braziliensis un L. infantum chagasi, aktivizē NLRP3 un ASC atkarīgo kaspazi-1 makrofāgos, kā arī Leishmania infekciju.Parazītu replikācija ir uzlabota pelēm, kurām trūkst NLRP3/ASC/kaspāzes-1 gēna [11].Zamboni et al.Ir ziņots, ka Leishmania infekcija izraisa NLRP3 iekaisuma aktivāciju makrofāgos, kas ierobežo intracelulāro parazītu replikāciju.Tādējādi Leishmania var kavēt NLRP3 aktivāciju kā izvairīšanās stratēģiju.In vivo pētījumos NLRP3 iekaisums veicināja leišmanijas izvadīšanu, bet neietekmēja audus [54].Un otrādi, helmintozes pētījumos NLRP3 iekaisuma aktivizēšana nomāca saimnieka aizsargājošo imunitāti pret kuņģa-zarnu trakta helmintiāzi [12].Shigella ir viena no galvenajām baktērijām, kas visā pasaulē izraisa caureju.Šīs baktērijas var izraisīt IL-1β veidošanos, izmantojot P2X7 receptoru mediētu K+ izplūdi, reaktīvās skābekļa sugas, lizosomu paskābināšanos un mitohondriju bojājumus.NLRP3 iekaisuma process negatīvi regulē makrofāgu fagocitozi un baktericīdo aktivitāti pret Shigella [55].Plasmodium pētījumi ir parādījuši, ka AIM2, NLRP3 vai kaspāzes-1 deficīta peles, kas inficētas ar Plasmodium, rada augstu 1. tipa interferona līmeni un ir izturīgākas pret Plasmodium infekciju [56].Tomēr nav skaidra alfa-2 giardīna un alfa-7.3 giardīna loma NLRP3 iekaisuma patogēnas aktivācijas izraisīšanā pelēm.
Šajā pētījumā NLRP3 iekaisuma inhibīcija ar MCC950 samazināja BW un palielināja trofozoītu skaitu zarnu skalošanas šķidrumā pelēm, izraisot smagākas patoloģiskas izmaiņas divpadsmitpirkstu zarnas audos.Alfa-2 giardīns un alfa-7.3 giardīns aktivizē saimniekpeles NLRP3 iekaisumu, palielina peles ķermeņa svaru, samazina trofozoītu skaitu zarnu skalošanas šķidrumā un mazina patoloģiskus divpadsmitpirkstu zarnas bojājumus.Šie rezultāti liecina, ka G. duodenalis var aktivizēt NLRP3 saimnieka iekaisumu caur alfa-2 giardīnu un alfa-7,3 giardīnu, samazinot G. duodenalis patogenitāti pelēm.
Kopumā mūsu rezultāti parāda, ka alfa-2 un alfa-7.3 giardīnas izraisa NLRP3 saimnieka iekaisuma aktivāciju un samazina G. duodenalis infekciozitāti pelēm.Tāpēc šīs molekulas ir daudzsološi mērķi giardiazes profilaksei.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: pārskats.Nesen atklājās, ka Pat Inflamm ir alerģija pret zālēm.2019; 13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: pārskats par farmakoterapiju.Farmaceita eksperta atzinums.2007. gads;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, zāļu rezistence un jaunu mērķu atklāšana.Inficē Disord narkotiku mērķus.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T uc NLRP3 iekaisuma un iekaisuma slimības.Oxide Med Cell Longev.2020; 2020: 4063562.
Chen GY, Núñez G. Iekaisuma loma zarnu iekaisuma un vēža gadījumā.Gastroenteroloģija.2011. gads;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Kanoniskā un netipiskā NLRP3 iekaisuma aktivācija imūnās tolerances un zarnu iekaisuma krustcelēs.pirmsimūns.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S u.c.Reakcijā uz N. caninum infekciju ir iesaistīta ROS mediētā NLRP3 iekaisuma aktivācija.Parazītu vektors.2020; 13:449.