Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Gēnu vektoriem plaušu cistiskās fibrozes ārstēšanai jābūt vērstiem uz vadošajiem elpceļiem, jo ​​perifēro plaušu transdukcijai nav terapeitiskas iedarbības.Vīrusu transdukcijas efektivitāte ir tieši saistīta ar nesēja uzturēšanās laiku.Tomēr ievadīšanas šķidrumi, piemēram, gēnu nesēji, inhalācijas laikā dabiski izkliedējas alveolos, un jebkuras formas terapeitiskās daļiņas tiek ātri noņemtas ar mukociliāru transportu.Gēnu nesēju uzturēšanās laika pagarināšana elpceļos ir svarīga, taču grūti panākama.Ar nesēju konjugētas magnētiskās daļiņas, kuras var novirzīt uz elpceļu virsmu, var uzlabot reģionālo mērķauditorijas atlasi.In vivo attēlveidošanas problēmu dēļ šādu mazu magnētisko daļiņu uzvedība uz elpceļu virsmas pielietotā magnētiskā lauka klātbūtnē ir slikti izprotama.Šī pētījuma mērķis bija izmantot sinhrotronu attēlveidošanu, lai vizualizētu in vivo magnētisko daļiņu kustību anestēzijas žurku trahejā, lai pētītu atsevišķu un lielapjoma daļiņu dinamiku un uzvedības modeļus in vivo.Pēc tam mēs arī novērtējām, vai lentivīrusu magnētisko daļiņu piegāde magnētiskā lauka klātbūtnē palielinātu transdukcijas efektivitāti žurkas trahejā.Sinhrotrona rentgena attēlveidošana parāda magnētisko daļiņu uzvedību stacionāros un kustīgos magnētiskajos laukos in vitro un in vivo.Daļiņas nevar viegli vilkt pa dzīvo elpceļu virsmu, izmantojot magnētus, bet transportēšanas laikā nogulsnes koncentrējas redzes laukā, kur magnētiskais lauks ir spēcīgākais.Transdukcijas efektivitāte tika palielināta arī sešas reizes, kad lentivīrusu magnētiskās daļiņas tika piegādātas magnētiskā lauka klātbūtnē.Kopumā šie rezultāti liecina, ka lentivīrusu magnētiskās daļiņas un magnētiskie lauki var būt vērtīgas pieejas, lai uzlabotu gēnu vektora mērķēšanu un transdukcijas līmeni vadošajos elpceļos in vivo.
Cistisko fibrozi (CF) izraisa viena gēna variācijas, ko sauc par CF transmembrānas vadītspējas regulatoru (CFTR).CFTR proteīns ir jonu kanāls, kas atrodas daudzās epitēlija šūnās visā organismā, tostarp elpceļos, kas ir galvenā cistiskās fibrozes patoģenēzes vieta.CFTR defekti izraisa patoloģisku ūdens transportēšanu, elpceļu virsmas dehidratāciju un elpceļu virsmas šķidruma slāņa (ASL) dziļuma samazināšanos.Tas arī pasliktina mucociliary transport (MCT) sistēmas spēju attīrīt elpceļus no ieelpotajām daļiņām un patogēniem.Mūsu mērķis ir izstrādāt lentivīrusu (LV) gēnu terapiju, lai nodrošinātu pareizu CFTR gēna kopiju un uzlabotu ASL, MCT un plaušu veselību, kā arī turpināt izstrādāt jaunas tehnoloģijas, kas var izmērīt šos parametrus in vivo1.
LV vektori ir viens no vadošajiem cistiskās fibrozes gēnu terapijas kandidātiem, galvenokārt tāpēc, ka tie var pastāvīgi integrēt terapeitisko gēnu elpceļu bazālajās šūnās (elpceļu cilmes šūnās).Tas ir svarīgi, jo tie var atjaunot normālu hidratāciju un gļotu klīrensu, diferencējoties funkcionālās gēnu koriģētās elpceļu virsmas šūnās, kas saistītas ar cistisko fibrozi, radot ieguvumus mūža garumā.LV vektoriem jābūt vērstiem pret vadošajiem elpceļiem, jo ​​šeit sākas plaušu iesaistīšanās CF.Vektora ievadīšana dziļāk plaušās var izraisīt alveolāru transdukciju, taču tam nav terapeitiskas iedarbības cistiskās fibrozes gadījumā.Tomēr šķidrumi, piemēram, gēnu nesēji, dabiski migrē alveolās, kad tos ieelpo pēc dzemdībām3, 4, un MCT ātri izvada terapeitiskās daļiņas mutes dobumā.LV transdukcijas efektivitāte ir tieši saistīta ar laiku, kurā vektors atrodas tuvu mērķa šūnām, lai nodrošinātu šūnu uzņemšanu – “uzturēšanās laiks” 5, ko viegli saīsina tipiska reģionālā gaisa plūsma, kā arī koordinēta gļotu un MCT daļiņu uzņemšana.Cistiskās fibrozes gadījumā spēja pagarināt LV uzturēšanās laiku elpceļos ir svarīga, lai sasniegtu augstu transdukcijas līmeni šajā jomā, taču līdz šim tā ir bijusi sarežģīta.
Lai pārvarētu šo šķērsli, mēs ierosinām, ka LV magnētiskās daļiņas (MP) var palīdzēt divos papildu veidos.Pirmkārt, tos var vadīt ar magnētu uz elpceļu virsmu, lai uzlabotu mērķēšanu un palīdzētu gēnu nesēju daļiņām atrasties pareizajā elpceļu zonā;un ASL) pārvietojas šūnu slānī 6. MP tiek plaši izmantoti kā mērķtiecīgi zāļu ievadīšanas nesēji, kad tie saistās ar antivielām, ķīmijterapijas zālēm vai citām mazām molekulām, kas piestiprinās pie šūnu membrānām vai saistās ar to attiecīgajiem šūnu virsmas receptoriem un uzkrājas audzēja vietās statiskās elektrības klātbūtne.Magnētiskie lauki vēža terapijai 7. Citas “hipertermiskās” metodes ir vērstas uz audzēja šūnu iznīcināšanu, karsējot MP, ja tās tiek pakļautas svārstīgo magnētisko lauku iedarbībai.Magnētiskās transfekcijas princips, kurā magnētiskais lauks tiek izmantots kā transfekcijas līdzeklis, lai veicinātu DNS pārnešanu šūnās, parasti tiek izmantots in vitro, izmantojot virkni nevīrusu un vīrusu gēnu vektoru grūti transducējamām šūnu līnijām. ..Tika noteikta LV magnetotransfekcijas efektivitāte, ievadot LV MP in vitro cilvēka bronhu epitēlija šūnu līnijā statiskā magnētiskā lauka klātbūtnē, palielinot transdukcijas efektivitāti 186 reizes, salīdzinot ar LV vektoru vien.LV MT ir izmantots arī cistiskās fibrozes in vitro modelī, kur magnētiskā transfekcija palielināja LV transdukciju gaisa un šķidruma saskarnes kultūrās 20 reizes cistiskās fibrozes krēpu klātbūtnē10.Tomēr in vivo orgānu magnetotransfekcijai ir pievērsta salīdzinoši maza uzmanība, un tā ir novērtēta tikai dažos pētījumos ar dzīvniekiem 11, 12, 13, 14, 15, īpaši plaušās 16, 17.Tomēr magnētiskās transfekcijas iespējas plaušu terapijā cistiskās fibrozes gadījumā ir skaidras.Tan et al.(2020) norādīja, ka "apstiprinājuma pētījums par efektīvu magnētisko nanodaļiņu ievadīšanu plaušās pavērs ceļu turpmākām CFTR inhalācijas stratēģijām, lai uzlabotu klīniskos rezultātus pacientiem ar cistisko fibrozi"6.
Mazo magnētisko daļiņu uzvedību uz elpceļu virsmas pielietota magnētiskā lauka klātbūtnē ir grūti vizualizēt un pētīt, tāpēc tās ir slikti izprotamas.Citos pētījumos mēs esam izstrādājuši uz sinhrotronu izplatīšanos balstītu fāzes kontrasta rentgena attēlveidošanas (PB-PCXI) metodi neinvazīvai attēlveidošanai un nelielu ASL18 dziļuma un MCT19 uzvedības in vivo izmaiņu kvantitatīvai noteikšanai20, lai tieši izmērītu gāzes kanālu virsmas hidratāciju. un tiek izmantots kā agrīns ārstēšanas efektivitātes indikators.Turklāt mūsu MCT vērtēšanas metode izmanto 10–35 µm diametra daļiņas, kas sastāv no alumīnija oksīda vai stikla ar augstu refrakcijas indeksu, kā MCT marķierus, kas redzami ar PB-PCXI21.Abas metodes ir piemērotas dažādu daļiņu veidu, tostarp MP, attēlveidošanai.
Augstās telpiskās un laika izšķirtspējas dēļ mūsu uz PB-PCXI balstītie ASL un MCT testi ir labi piemēroti, lai pētītu atsevišķu un lielapjoma daļiņu dinamiku un uzvedības modeļus in vivo, lai palīdzētu mums izprast un optimizēt MP gēnu piegādes metodes.Šeit izmantotā pieeja ir balstīta uz mūsu pētījumiem, izmantojot SPring-8 BL20B2 staru līniju, kurā mēs vizualizējām šķidruma kustību pēc fiktīva vektora devas ievadīšanas peļu deguna un plaušu elpceļos, lai palīdzētu izskaidrot mūsu novērotos neviendabīgos gēnu ekspresijas modeļus. mūsu gēnā.pētījumi ar dzīvniekiem ar nesējdevu 3,4 .
Šī pētījuma mērķis bija izmantot PB-PCXI sinhrotronu, lai vizualizētu MP sērijas in vivo kustības dzīvu žurku trahejā.Šie PB-PCXI attēlveidošanas pētījumi tika izstrādāti, lai pārbaudītu MP sēriju, magnētiskā lauka stiprumu un atrašanās vietu, lai noteiktu to ietekmi uz MP kustību.Mēs pieņēmām, ka ārējais magnētiskais lauks palīdzētu piegādātajam MF palikt vai pārvietoties uz mērķa zonu.Šie pētījumi arī ļāva mums noteikt magnētu konfigurācijas, kas maksimāli palielina trahejā pēc nogulsnēšanās palikušo daļiņu daudzumu.Otrajā pētījumu sērijā mēs centāmies izmantot šo optimālo konfigurāciju, lai parādītu transdukcijas modeli, kas izriet no LV-MP ievadīšanas in vivo žurku elpceļos, pieņemot, ka LV-MP ievadīšana elpceļu mērķēšanas kontekstā radītu. palielināta LV transdukcijas efektivitāte..
Visi pētījumi ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Adelaidas Universitātes (M-2019-060 un M-2020-022) un SPring-8 Synchrotron Animal ētikas komitejas apstiprinātiem protokoliem.Eksperimenti tika veikti saskaņā ar ARRIVE ieteikumiem.
Visi rentgena attēli tika uzņemti BL20XU staru līnijā SPring-8 sinhrotronā Japānā, izmantojot iestatījumu, kas ir līdzīgs iepriekš aprakstītajam 21, 22.Īsumā, eksperimentālā kaste atradās 245 m no sinhrotrona uzglabāšanas gredzena.Attālums no parauga līdz detektoram tiek izmantots daļiņu attēlveidošanas pētījumos un 0,3 m attālums in vivo attēlveidošanas pētījumos, lai radītu fāzes kontrasta efektus.Tika izmantots monohromatisks stars ar enerģiju 25 keV.Attēli tika iegūti, izmantojot augstas izšķirtspējas rentgenstaru devēju (SPring-8 BM3), kas savienots ar sCMOS detektoru.Pārveidotājs pārveido rentgena starus redzamā gaismā, izmantojot 10 µm biezu scintilatoru (Gd3Al2Ga3O12), kas pēc tam tiek novirzīts uz sCMOS sensoru, izmantojot ×10 (NA 0,3) mikroskopa objektīvu.sCMOS detektors bija Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japāna) ar masīva izmēru 2048 × 2048 pikseļi un neapstrādāto pikseļu izmēru 6,5 × 6,5 µm.Šis iestatījums nodrošina efektīvo izotropo pikseļu izmēru 0,51 µm un redzes lauku aptuveni 1,1 mm × 1,1 mm.Ekspozīcijas ilgums 100 ms tika izvēlēts, lai maksimāli palielinātu magnētisko daļiņu signāla un trokšņa attiecību elpceļos un ārpus tām, vienlaikus samazinot kustības artefaktus, ko izraisa elpošana.In vivo pētījumiem rentgenstaru ceļā tika novietots ātrs rentgena aizvars, lai ierobežotu starojuma devu, bloķējot rentgena staru staru kūli starp ekspozīcijām.
LV datu nesējs netika izmantots nevienā SPring-8 PB-PCXI attēlveidošanas pētījumā, jo BL20XU attēlveidošanas kamerai nav 2. bioloģiskās drošības līmeņa sertifikāta.Tā vietā mēs atlasījām virkni labi raksturotu MP no diviem komerciāliem pārdevējiem, kas aptver dažādu izmēru, materiālu, dzelzs koncentrāciju un lietojumu diapazonu. Vispirms, lai saprastu, kā magnētiskie lauki ietekmē MP kustību stikla kapilāros, un pēc tam dzīvie elpceļi.virsmas.MP izmērs svārstās no 0,25 līdz 18 µm un ir izgatavots no dažādiem materiāliem (sk. 1. tabulu), bet katra parauga sastāvs, ieskaitot MP magnētisko daļiņu izmēru, nav zināms.Pamatojoties uz mūsu plašajiem MCT pētījumiem 19, 20, 21, 23, 24, mēs sagaidām, ka MP līdz 5 µm var redzēt uz trahejas elpceļu virsmas, piemēram, atņemot secīgus kadrus, lai redzētu uzlabotu MP kustības redzamību.Viens MP 0,25 µm ir mazāks par attēlveidošanas ierīces izšķirtspēju, taču ir paredzams, ka PB-PCXI pēc nogulsnēšanas noteiks to tilpuma kontrastu un virsmas šķidruma kustību, uz kuras tie ir nogulsnēti.
Paraugi katram MP tabulā.1 tika sagatavots 20 μl stikla kapilāros (Drummond Microcaps, PA, ASV) ar iekšējo diametru 0, 63 mm.Korpuskulārās daļiņas ir pieejamas ūdenī, savukārt CombiMag daļiņas ir pieejamas ražotāja patentētajā šķidrumā.Katra caurule ir līdz pusei piepildīta ar šķidrumu (apmēram 11 µl) un novietota uz parauga turētāja (sk. 1. attēlu).Stikla kapilāri tika novietoti horizontāli uz skatuves attiecīgi attēlveidošanas kamerā un novietoti šķidruma malās.19 mm diametra (28 mm garš) niķeļa apvalka magnēts, kas izgatavots no retzemju, neodīma, dzelzs un bora (NdFeB) (N35, kat. nr. LM1652, Jaycar Electronics, Austrālija) ar remanenci 1,17 T tika piestiprināts atsevišķa pārsūtīšanas tabula, lai sasniegtu Attālināti mainīt savu pozīciju renderēšanas laikā.Rentgena attēlveidošana sākas, kad magnēts ir novietots aptuveni 30 mm virs parauga un attēli tiek iegūti ar ātrumu 4 kadri sekundē.Attēlveidošanas laikā magnēts tika pietuvināts stikla kapilārajai caurulei (apmēram 1 mm attālumā) un pēc tam pārvietots pa cauruli, lai novērtētu lauka intensitātes un stāvokļa ietekmi.
In vitro attēlveidošanas iekārta, kas satur MP paraugus stikla kapilāros xy parauga translācijas stadijā.Rentgena stara ceļš ir atzīmēts ar sarkanu punktētu līniju.
Kad tika noteikta MP in vitro redzamība, to apakškopa tika pārbaudīta in vivo ar savvaļas tipa Wistar albīnu žurku mātītēm (~ 12 nedēļas vecas, ~ 200 g).Medetomidīns 0,24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Japāna), midazolāms 3,2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Japāna) un butorfanols 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Žurkas tika anestēzētas ar Pharma (Japāna) maisījumu, veicot intraperitoneālu injekciju.Pēc anestēzijas tos sagatavoja attēlveidošanai, noņemot kažokādu ap traheju, ievietojot endotraheālo caurulīti (ET; 16 Ga intravenoza kanula, Terumo BCT) un imobilizējot tos guļus stāvoklī uz īpaši izgatavotas attēlveidošanas plāksnes, kurā bija termomaiss. lai uzturētu ķermeņa temperatūru.22. Pēc tam attēlveidošanas plāksne tika piestiprināta pie parauga stadijas attēlveidošanas kastē nelielā leņķī, lai traheja horizontāli izlīdzinātu rentgena attēlu, kā parādīts 2.a attēlā.
(a) In vivo attēlveidošanas iestatīšana attēlveidošanas blokā SPring-8, rentgenstaru stara ceļš apzīmēts ar sarkanu punktētu līniju.( b, c ) Trahejas magnēta lokalizācija tika veikta attālināti, izmantojot divas ortogonāli uzstādītas IP kameras.Attēla kreisajā pusē ekrānā ir redzama stieples cilpa, kas tur galvu, un ET caurules iekšpusē uzstādīta piegādes kanula.
Tālvadības šļirču sūkņa sistēma (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), izmantojot 100 µl stikla šļirci, tika savienota ar PE10 cauruli (0,61 mm OD, 0,28 mm ID), izmantojot 30 Ga adatu.Ievietojot endotraheālo caurulīti, atzīmējiet cauruli, lai nodrošinātu, ka uzgalis trahejā atrodas pareizā stāvoklī.Izmantojot mikrosūkni, šļirces virzulis tika noņemts un mēģenes gals tika iegremdēts piegādājamajā MP paraugā.Pēc tam ielādētā piegādes caurule tika ievietota endotraheālajā caurulē, novietojot galu mūsu paredzamā pielietotā magnētiskā lauka spēcīgākajā daļā.Attēla iegūšana tika kontrolēta, izmantojot elpas detektoru, kas savienots ar mūsu Arduino bāzes laika kārbu, un visi signāli (piemēram, temperatūra, elpošana, aizvara atvēršana/aizvēršana un attēla iegūšana) tika reģistrēti, izmantojot Powerlab un LabChart (AD Instruments, Sidneja, Austrālija). 22 Attēlveidošanas laikā Kad korpuss nebija pieejams, divas IP kameras (Panasonic BB-SC382) tika novietotas aptuveni 90° leņķī viena pret otru un tika izmantotas, lai kontrolētu magnēta pozīciju attiecībā pret traheju attēlveidošanas laikā (2.b, c attēls).Lai samazinātu kustības artefaktus, terminālās elpošanas plūsmas plato laikā tika iegūts viens attēls katrā elpas vilcienā.
Magnēts ir piestiprināts pie otrās pakāpes, kas var atrasties attālināti attēlveidošanas korpusa ārpusē.Tika pārbaudītas dažādas magnēta pozīcijas un konfigurācijas, tostarp: novietots aptuveni 30° leņķī virs trahejas (konfigurācijas parādītas 2.a un 3.a attēlā);viens magnēts virs dzīvnieka un otrs zem, ar stabiem, kas iestatīti pievilkšanai (3.b attēls)., viens magnēts virs dzīvnieka un viens zemāk, ar poliem, kas iestatīti atgrūšanai (3.c attēls), un viens magnēts virs trahejas un perpendikulāri tai (3.d attēls).Pēc dzīvnieka un magnēta uzstādīšanas un pārbaudāmā MP ievietošanas šļirces sūknī, pēc attēlu iegūšanas ievadiet 50 µl devu ar ātrumu 4 µl/s.Pēc tam magnēts tiek pārvietots uz priekšu un atpakaļ gar traheju vai pāri tai, turpinot iegūt attēlus.
Magnēta konfigurācija in vivo attēlveidošanai (a) viens magnēts virs trahejas aptuveni 30° leņķī, (b) divi magnēti, kas konfigurēti pievilkšanai, (c) divi magnēti, kas konfigurēti atgrūšanai, (d) viens magnēts virs trahejas un perpendikulāri tai. traheja.Novērotājs skatījās lejup no mutes uz plaušām caur traheju, un rentgena stars izgāja caur žurkas kreiso pusi un izgāja no labās puses.Magnēts tiek pārvietots pa elpceļu garumu vai pa kreisi un pa labi virs trahejas rentgena staru kūļa virzienā.
Mēs arī centāmies noteikt daļiņu redzamību un uzvedību elpceļos, ja elpošana un sirdsdarbība nesajaucas.Tāpēc attēlveidošanas perioda beigās dzīvnieki tika humāni eitanizēti pentobarbitāla pārdozēšanas dēļ (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, ASV; ~ 65 mg/kg ip).Daži dzīvnieki tika atstāti uz attēlveidošanas platformas, un pēc elpošanas un sirdsdarbības pārtraukšanas attēlveidošanas process tika atkārtots, pievienojot papildu MP devu, ja MP nebija redzams uz elpceļu virsmas.
Iegūtie attēli tika koriģēti attiecībā uz plakanu un tumšu lauku un pēc tam tika apkopoti filmā (20 kadri sekundē; 15–25 × normāls ātrums atkarībā no elpošanas ātruma), izmantojot pielāgotu skriptu, kas rakstīts MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Visi pētījumi par LV gēnu vektora piegādi tika veikti Adelaidas Universitātes laboratorijas dzīvnieku pētniecības centrā, un to mērķis bija izmantot SPring-8 eksperimenta rezultātus, lai novērtētu, vai LV-MP piegāde magnētiskā lauka klātbūtnē varētu uzlabot gēnu pārnesi in vivo .Lai novērtētu MF un magnētiskā lauka ietekmi, tika ārstētas divas dzīvnieku grupas: vienai grupai tika injicēts LV MF ar magnēta izvietojumu, bet otrai grupai tika ievadīts kontroles grupa ar LV MF bez magnēta.
LV gēnu vektori ir ģenerēti, izmantojot iepriekš aprakstītās metodes 25, 26 .LacZ vektors ekspresē kodolā lokalizētu beta-galaktozidāzes gēnu, ko virza MPSV konstitutīvais promotors (LV-LacZ), kas transducētajās šūnās rada zilu reakcijas produktu, kas ir redzams plaušu audu frontēs un sekcijās.Titrēšana tika veikta šūnu kultūrās, manuāli skaitot LacZ pozitīvo šūnu skaitu, izmantojot hemocitometru, lai aprēķinātu titru TU / ml.Nesējvielas tiek uzglabātas kriokonservētas -80°C temperatūrā, pirms lietošanas atkausētas un savienotas ar CombiMag, sajaucot 1:1 un inkubējot uz ledus vismaz 30 minūtes pirms piegādes.
Parastas Sprague Dawley žurkas (n = 3/grupa, ~2-3 anestēzijas ip ar 0,4 mg/kg medetomidīna (Domitor, Ilium, Austrālija) un 60 mg/kg ketamīna (Ilium, Austrālija) maisījumu 1 mēneša vecumā) ip ) injekcija un neķirurģiska perorāla kanulēšana ar 16 Ga intravenozo kanulu.Lai nodrošinātu, ka trahejas elpceļu audi saņem LV transdukciju, tie tika kondicionēti, izmantojot mūsu iepriekš aprakstīto mehāniskās perturbācijas protokolu, kurā trahejas elpceļu virsma tika aksiāli berzēta ar stiepļu grozu (N-Circle, nitinola akmens ekstraktors bez uzgaļa NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ASV) 30 p28.Pēc tam apmēram 10 minūtes pēc traucējumiem bioloģiskās drošības kabinetā tika veikta LV-MP ievadīšana trahejā.
Šajā eksperimentā izmantotais magnētiskais lauks tika konfigurēts līdzīgi kā in vivo rentgena pētījumā, ar tiem pašiem magnētiem, kas tika turēti virs trahejas ar destilācijas stenta skavām (4. attēls).50 µl tilpums (2 x 25 µl alikvotas) LV-MP tika ievadīts trahejā (n = 3 dzīvnieki), izmantojot pipeti ar gēla galu, kā aprakstīts iepriekš.Kontroles grupa (n = 3 dzīvnieki) saņēma to pašu LV-MP, neizmantojot magnētu.Pēc infūzijas pabeigšanas kanulu izņem no endotraheālās caurules un dzīvnieku ekstubē.Magnēts paliek vietā 10 minūtes pirms tiek noņemts.Žurkām subkutāni ievadīja meloksikāmu (1 ml/kg) (Ilium, Austrālija), kam sekoja anestēzijas pārtraukšana, intraperitoneāli ievadot 1 mg/kg atipamazola hidrohlorīda (Antisedan, Zoetis, Austrālija).Žurkas tika turētas siltas un novērotas līdz pilnīgai atveseļošanai no anestēzijas.
LV-MP piegādes ierīce bioloģiskās drošības skapī.Var redzēt, ka ET caurules gaiši pelēkā Luer-lock uzmava izvirzās no mutes, un attēlā redzamais gēla pipetes uzgalis tiek ievietots caur ET cauruli vēlamajā dziļumā trahejā.
Vienu nedēļu pēc LV-MP ievadīšanas procedūras dzīvnieki tika humāni nonāvēti, ieelpojot 100% CO2, un LacZ ekspresija tika novērtēta, izmantojot mūsu standarta X-gal ārstēšanu.Trīs visvairāk astes skrimšļa gredzeni tika noņemti, lai nodrošinātu, ka analīzē netiks iekļauti jebkādi mehāniski bojājumi vai šķidruma aizturi endotraheālās caurules novietojuma dēļ.Katra traheja tika sagriezta gareniski, lai iegūtu divas puses analīzei, un ievietota kausā, kas satur silikona gumiju (Sylgard, Dow Inc), izmantojot Minutien adatu (Fine Science Tools), lai vizualizētu luminālo virsmu.Transducēto šūnu sadalījums un raksturs tika apstiprināts ar frontālo fotogrāfiju, izmantojot Nikon mikroskopu (SMZ1500) ar DigiLite kameru un TCapture programmatūru (Tucsen Photonics, Ķīna).Attēli tika iegūti 20x palielinājumā (ieskaitot maksimālo iestatījumu visam trahejas platumam), soli pa solim attēlojot visu trahejas garumu, nodrošinot pietiekamu pārklāšanos starp katru attēlu, lai attēlus varētu “sašūt”.Pēc tam attēli no katras trahejas tika apvienoti vienā saliktā attēlā, izmantojot Composite Image Editor versiju 2.0.3 (Microsoft Research), izmantojot plakanās kustības algoritmu. LacZ ekspresijas laukums katra dzīvnieka trahejas saliktajos attēlos tika kvantificēts, izmantojot automatizētu MATLAB skriptu (R2020a, MathWorks), kā aprakstīts iepriekš28, izmantojot iestatījumus 0,35 < Hue < 0,58, Saturation> 0,15 un Value < 0,7. LacZ izteiksmes laukums katra dzīvnieka trahejas saliktajos attēlos tika kvantificēts, izmantojot automatizētu MATLAB skriptu (R2020a, MathWorks), kā aprakstīts iepriekš28, izmantojot iestatījumus 0,35 < Hue < 0,58, Saturation> 0,15 un Value < 0,7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественисна количественене оп изированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, нашна>0,58, насых ,7. LacZ ekspresijas laukums saliktos trahejas attēlos no katra dzīvnieka tika kvantificēts, izmantojot automatizētu MATLAB skriptu (R2020a, MathWorks), kā aprakstīts iepriekš28, izmantojot iestatījumus 0,35.0,15 un vērtība <0 ,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复AC囡进行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置.如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 珪 的 嚃 嚏 复表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。. .................... GURNS Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определичественно определинеполи с сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15,7ениезначе, . LacZ izteiksmes apgabali katra dzīvnieka trahejas saliktajos attēlos tika kvantificēti, izmantojot automatizētu MATLAB skriptu (R2020a, MathWorks), kā aprakstīts iepriekš, izmantojot iestatījumus 0,35 <nokrāsa <0,58, piesātinājums> 0,15 un vērtība <0,7.Izsekojot audu kontūras GIMP v2.10.24, katram saliktajam attēlam tika manuāli izveidota maska, lai identificētu audu apgabalu un novērstu nepatiesu noteikšanu ārpus trahejas audiem.Iekrāsotie laukumi no visiem saliktajiem attēliem no katra dzīvnieka tika summēti, lai iegūtu kopējo šī dzīvnieka iekrāsoto laukumu.Pēc tam krāsotais laukums tika sadalīts ar kopējo maskas laukumu, lai iegūtu normalizētu laukumu.
Katra traheja tika iestrādāta parafīnā un sadalīta 5 µm biezumā.Sekcijas tika iekrāsotas ar neitrālu, ātri sarkanu krāsu 5 minūtes, un attēli tika iegūti, izmantojot Nikon Eclipse E400 mikroskopu, DS-Fi3 kameru un NIS elementu uztveršanas programmatūru (versija 5.20.00).
Visas statistiskās analīzes tika veiktas GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Statistiskais nozīmīgums tika iestatīts uz p ≤ 0,05.Normalitāte tika pārbaudīta, izmantojot Shapiro-Wilk testu, un atšķirības LacZ krāsošanā tika novērtētas, izmantojot nepāra t-testu.
Sešus 1. tabulā aprakstītos MP pārbaudīja ar PCXI, un redzamība ir aprakstīta 2. tabulā. PCXI nebija redzami divi polistirola MP (attiecīgi MP1 un MP2; 18 µm un 0,25 µm), bet atlikušos paraugus varēja identificēt. (piemēri ir parādīti 5. attēlā).MP3 un MP4 ir vāji redzami (attiecīgi 10-15% Fe3O4; 0,25 µm un 0,9 µm).Lai gan MP5 (98% Fe3O4; 0,25 µm) saturēja dažas no mazākajām pārbaudītajām daļiņām, tā bija visizteiktākā.CombiMag MP6 produktu ir grūti atšķirt.Visos gadījumos mūsu spēja noteikt MF tika ievērojami uzlabota, pārvietojot magnētu uz priekšu un atpakaļ paralēli kapilāram.Magnētiem attālinoties no kapilāra, daļiņas tika izvilktas garās ķēdēs, bet, magnētiem tuvojoties un palielinoties magnētiskā lauka stiprumam, daļiņu ķēdes saīsinājās, daļiņām migrējot uz kapilāra augšējo virsmu (skat. Papildu video S1 : MP4), palielinot daļiņu blīvumu uz virsmas.Un otrādi, kad magnēts tiek noņemts no kapilāra, lauka stiprums samazinās un MP pārkārtojas garās ķēdēs, kas stiepjas no kapilāra augšējās virsmas (skatiet Papildu video S2: MP4).Pēc tam, kad magnēts pārstāj kustēties, daļiņas turpina kustēties kādu laiku pēc līdzsvara stāvokļa sasniegšanas.MP virzoties uz kapilāra augšējo virsmu un prom no tās, magnētiskajām daļiņām ir tendence caur šķidrumu izvilkt gružus.
MP redzamība PCXI ietvaros ievērojami atšķiras starp paraugiem.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 un (d) MP6.Visi šeit redzamie attēli tika uzņemti ar magnētu, kas novietots aptuveni 10 mm tieši virs kapilāra.Šķietamie lielie apļi ir kapilāros iesprostoti gaisa burbuļi, kas skaidri parāda fāzes kontrasta attēla melnbaltās malas iezīmes.Sarkanais lodziņš norāda palielinājumu, kas uzlabo kontrastu.Ņemiet vērā, ka magnētu ķēžu diametri visos attēlos nav mērogā un ir aptuveni 100 reizes lielāki nekā parādīts.
Magnētam pārvietojoties pa kreisi un pa labi gar kapilāra augšpusi, MP virknes leņķis mainās, lai saskaņotos ar magnētu (sk. 6. attēlu), tādējādi iezīmējot magnētiskā lauka līnijas.MP3-5 gadījumā, kad horda sasniedz sliekšņa leņķi, daļiņas velkas gar kapilāra augšējo virsmu.Tas bieži izraisa MP sagrupēšanos lielākās grupās netālu no vietas, kur magnētiskais lauks ir spēcīgākais (skatiet Papildu video S3: MP5).Tas ir īpaši redzams arī tad, ja attēlu veido tuvu kapilāra galam, kas izraisa MP agregāciju un koncentrēšanos šķidruma un gaisa saskarnē.MP6 daļiņas, kuras bija grūtāk atšķirt nekā MP3-5, nevilkās, kad magnēts pārvietojās pa kapilāru, bet MP virknes atdalījās, atstājot daļiņas redzamā vietā (skatiet Papildu video S4: MP6).Dažos gadījumos, kad pielietotais magnētiskais lauks tika samazināts, pārvietojot magnētu lielā attālumā no attēlveidošanas vietas, visi atlikušie MP lēnām nolaidās uz caurules apakšējo virsmu gravitācijas ietekmē, paliekot virknē (skatiet Papildu video S5: MP3) .
MP virknes leņķis mainās, magnētam virzoties pa labi virs kapilāra.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 un (d) MP6.Sarkanais lodziņš norāda palielinājumu, kas uzlabo kontrastu.Lūdzu, ņemiet vērā, ka papildu videoklipi ir paredzēti informatīviem nolūkiem, jo ​​tie atklāj svarīgu daļiņu struktūru un dinamisku informāciju, ko nevar vizualizēt šajos statiskajos attēlos.
Mūsu testi ir parādījuši, ka magnēta lēna pārvietošana uz priekšu un atpakaļ pa traheju atvieglo MF vizualizāciju sarežģītas kustības kontekstā in vivo.In vivo testi netika veikti, jo polistirola lodītes (MP1 un MP2) kapilārā nebija redzamas.Katrs no atlikušajiem četriem MF tika pārbaudīts in vivo ar magnēta garo asi, kas novietota virs trahejas aptuveni 30° leņķī pret vertikāli (sk. 2.b un 3.a attēlu), jo tas radīja garākas MF ķēdes un bija efektīvākas. nekā magnēts..konfigurācija pārtraukta.MP3, MP4 un MP6 nav atrasti neviena dzīva dzīvnieka trahejā.Vizualizējot žurku elpceļus pēc dzīvnieku humānās nogalināšanas, daļiņas palika neredzamas pat tad, ja, izmantojot šļirces sūkni, tika pievienots papildu tilpums.MP5 bija visaugstākais dzelzs oksīda saturs, un tā bija vienīgā redzamā daļiņa, tāpēc to izmantoja, lai novērtētu un raksturotu MP uzvedību in vivo.
Magnēta novietošana virs trahejas MF ievietošanas laikā izraisīja to, ka daudzi, bet ne visi, MF tika koncentrēti redzes laukā.Daļiņu iekļūšanu trahejā vislabāk var novērot humāni eitanāzētiem dzīvniekiem.7. attēls un papildu video S6: MP5 parāda ātru daļiņu magnētisko uztveršanu un izlīdzināšanu uz ventrālās trahejas virsmas, norādot, ka MP var mērķēt uz vēlamajiem trahejas apgabaliem.Meklējot distālāk gar traheju pēc MF piegādes, daži MF tika atrasti tuvāk karīnai, kas norāda uz nepietiekamu magnētiskā lauka stiprumu, lai savāktu un noturētu visus MF, jo šķidruma ievadīšanas laikā tie tika piegādāti caur maksimālā magnētiskā lauka stipruma reģionu.process.Tomēr pēcdzemdību MP koncentrācija bija augstāka attēla apgabalā, kas liecina, ka daudzi MP palika elpceļu reģionos, kur pielietotā magnētiskā lauka stiprums bija visaugstākais.
Attēli (a) pirms un (b) pēc MP5 ievadīšanas nesen eitanāzētas žurkas trahejā ar magnētu, kas novietots tieši virs attēlveidošanas zonas.Attēlotais laukums atrodas starp diviem skrimšļainiem gredzeniem.Pirms MP piegādes elpceļos ir nedaudz šķidruma.Sarkanais lodziņš norāda palielinājumu, kas uzlabo kontrastu.Šie attēli ir ņemti no videoklipa, kas redzams S6: MP5 papildu video.
Magnēta pārvietošana pa traheju in vivo izraisīja MP ķēdes leņķa izmaiņas uz elpceļu virsmas, līdzīgi kā novērots kapilāros (sk. 8. attēlu un papildu video S7: MP5).Tomēr mūsu pētījumā deputātus nevarēja vilkt pa dzīvo elpošanas ceļu virsmu, kā to varētu darīt kapilāri.Dažos gadījumos MP ķēde pagarinās, magnētam pārvietojoties pa kreisi un pa labi.Interesanti, ka mēs arī atklājām, ka daļiņu ķēde maina šķidruma virsmas slāņa dziļumu, kad magnēts tiek pārvietots gareniski gar traheju, un izplešas, kad magnēts tiek pārvietots tieši virs galvas un daļiņu ķēde tiek pagriezta vertikālā stāvoklī (sk. Papildu video S7).: MP5 0:09, apakšā pa labi).Raksturīgais kustības modelis mainījās, kad magnēts tika pārvietots uz sāniem pāri trahejas augšdaļai (ti, pa kreisi vai pa labi no dzīvnieka, nevis gar trahejas garumu).Daļiņas joprojām bija skaidri redzamas to kustības laikā, bet, kad magnēts tika noņemts no trahejas, daļiņu virkņu gali kļuva redzami (skatiet Papildu video S8: MP5, sākot no 0:08).Tas sakrīt ar novēroto magnētiskā lauka uzvedību stikla kapilārā pielietotā magnētiskā lauka iedarbībā.
Attēlu paraugi, kuros redzams MP5 dzīvas anestēzijas žurkas trahejā.(a) Magnētu izmanto, lai iegūtu attēlus virs trahejas un pa kreisi no tās, pēc tam (b) pēc magnēta pārvietošanas pa labi.Sarkanais lodziņš norāda palielinājumu, kas uzlabo kontrastu.Šie attēli ir no videoklipa, kas redzams S7 papildu video: MP5.
Kad abi stabi tika noregulēti ziemeļu-dienvidu virzienā virs un zem trahejas (ti, piesaistot; 3.b att.), MP akordi parādījās garāki un atradās uz trahejas sānu sienas, nevis uz muguras virsmas. traheja (skatīt pielikumu).Video S9:MP5).Tomēr liela daļiņu koncentrācija vienā vietā (ti, trahejas muguras virsmā) netika konstatēta pēc šķidruma ievadīšanas, izmantojot divu magnētu ierīci, kas parasti notiek ar viena magnēta ierīci.Tad, kad viens magnēts tika konfigurēts, lai atvairītu pretējos polus (3.c attēls), redzamības laukā redzamo daļiņu skaits pēc piegādes nepalielinājās.Abu divu magnētu konfigurāciju iestatīšana ir sarežģīta augstā magnētiskā lauka intensitātes dēļ, kas attiecīgi piesaista vai nospiež magnētus.Pēc tam iestatījums tika mainīts uz vienu magnētu, kas ir paralēls elpceļiem, bet kas iet cauri elpceļiem 90 grādu leņķī, lai spēka līnijas šķērsotu trahejas sieniņu ortogonāli (3.d attēls), šī orientācija ir paredzēta, lai noteiktu daļiņu agregācijas iespējamību. sānu siena.jāievēro.Tomēr šajā konfigurācijā nebija identificējamas MF uzkrāšanās kustības vai magnēta kustības.Pamatojoties uz visiem šiem rezultātiem, gēnu nesēju in vivo pētījumiem tika izvēlēta konfigurācija ar vienu magnētu un 30 grādu orientāciju (3.a att.).
Kad dzīvnieks tika attēlots vairākas reizes tūlīt pēc humānās nogalināšanas, traucējošas audu kustības trūkums nozīmēja, ka skaidrā starpskrimšļu laukā varēja saskatīt smalkākas, īsākas daļiņu līnijas, kas “šūpojas” atbilstoši magnēta translācijas kustībai.skaidri redzēt MP6 daļiņu klātbūtni un kustību.
LV-LacZ titrs bija 1,8 x 108 SV/ml, un pēc sajaukšanas 1:1 ar CombiMag MP (MP6) dzīvniekiem injicēja 50 µl trahejas devas 9 x 107 SV/ml LV nesēja (ti, 4,5). x 106 TU/žurka).).).Šajos pētījumos tā vietā, lai pārvietotu magnētu dzemdību laikā, mēs fiksējām magnētu vienā pozīcijā, lai noteiktu, vai LV transdukciju var (a) uzlabot salīdzinājumā ar vektora piegādi, ja nav magnētiskā lauka, un (b) vai elpceļi varētu esi koncentrēts.Šūnas tiek transducētas augšējo elpceļu magnētiskajos mērķa apgabalos.
Magnētu klātbūtne un CombiMag lietošana kombinācijā ar LV vektoriem, šķiet, negatīvi neietekmēja dzīvnieku veselību, tāpat kā mūsu standarta LV vektora piegādes protokols.Mehāniskajai perturbācijai pakļautā trahejas reģiona frontālie attēli (1. papildu attēls) parādīja, ka grupai, kas tika ārstēta ar LV-MP, magnēta klātbūtnē bija ievērojami augstāks transdukcijas līmenis (9.a att.).Kontroles grupā bija tikai neliels zilā LacZ krāsojuma daudzums (9.b attēls).Ar X-Gal iekrāsoto normalizēto reģionu kvantitatīvā noteikšana parādīja, ka LV-MP ievadīšana magnētiskā lauka klātbūtnē uzlaboja aptuveni 6 reizes (9.c attēls).
Saliktu attēlu piemērs, kas parāda trahejas transdukciju ar LV-MP (a) magnētiskā lauka klātbūtnē un (b) bez magnēta.c) Statistiski nozīmīgs uzlabojums normalizētajā LacZ transdukcijas zonā trahejā, izmantojot magnētu (*p = 0,029, t-tests, n = 3 grupā, vidējā ± vidējā standarta kļūda).
Neitrālas, ātri sarkanas krāsas sekcijas (piemērs parādīts 2. papildu attēlā) norādīja, ka ar LacZ krāsotas šūnas bija tajā pašā paraugā un tajā pašā vietā, kā ziņots iepriekš.
Galvenais izaicinājums elpceļu gēnu terapijā joprojām ir precīza nesējdaļiņu lokalizācija interesējošos apgabalos un augsta līmeņa transdukcijas efektivitātes sasniegšana mobilajās plaušās gaisa plūsmas un aktīvas gļotu klīrensa klātbūtnē.LV nesējiem, kas paredzēti elpceļu slimību ārstēšanai cistiskās fibrozes gadījumā, nesējdaļiņu uzturēšanās laika palielināšana vadošajos elpceļos līdz šim ir bijis nesasniedzams mērķis.Kā norādīja Castellani et al., magnētisko lauku izmantošanai transdukcijas uzlabošanai ir priekšrocības salīdzinājumā ar citām gēnu piegādes metodēm, piemēram, elektroporāciju, jo tā var apvienot vienkāršību, ekonomiju, lokalizētu piegādi, palielinātu efektivitāti un īsāku inkubācijas laiku.un, iespējams, mazāka transportlīdzekļa deva10.Tomēr magnētisko daļiņu nogulsnēšanās un uzvedība elpceļos in vivo ārējo magnētisko spēku ietekmē nekad nav aprakstīta, un faktiski šīs metodes spēja paaugstināt gēnu ekspresijas līmeni neskartos dzīvos elpceļos nav pierādīta in vivo.
Mūsu in vitro eksperimenti ar PCXI sinhrotronu parādīja, ka visas mūsu pārbaudītās daļiņas, izņemot MP polistirolu, bija redzamas izmantotajā attēlveidošanas iestatījumā.Magnētiskā lauka klātbūtnē magnētiskie lauki veido virknes, kuru garums ir saistīts ar daļiņu veidu un magnētiskā lauka stiprumu (ti, magnēta tuvumu un kustību).Kā parādīts 10. attēlā, mūsu novērotās virknes veidojas, katrai atsevišķai daļiņai kļūstot magnetizētai un inducējot savu lokālo magnētisko lauku.Šie atsevišķie lauki liek citām līdzīgām daļiņām savākties un savienoties ar grupu virkņu kustībām vietējo spēku dēļ no vietējiem pievilkšanās un citu daļiņu atgrūšanas spēkiem.
Diagramma, kas parāda (a, b) daļiņu ķēdes, kas veidojas ar šķidrumu pildītajos kapilāros, un (c, d) ar gaisu piepildītā trahejā.Ņemiet vērā, ka kapilāri un traheja netiek pievilkti mērogā.Panelis (a) satur arī MF, kas satur ķēdēs sakārtotas Fe3O4 daļiņas, aprakstu.
Kad magnēts pārvietojās pāri kapilāram, daļiņu virknes leņķis sasniedza kritisko slieksni MP3-5, kas satur Fe3O4, pēc kura daļiņu virkne vairs nepalika sākotnējā stāvoklī, bet pārvietojās pa virsmu uz jaunu pozīciju.magnēts.Šis efekts, iespējams, rodas tāpēc, ka stikla kapilāra virsma ir pietiekami gluda, lai varētu notikt šī kustība.Interesanti, ka MP6 (CombiMag) neizturējās šādi, iespējams, tāpēc, ka daļiņas bija mazākas, tām bija atšķirīgs pārklājums vai virsmas lādiņš, vai arī patentētais nesējšķidrums ietekmēja to spēju pārvietoties.Arī CombiMag daļiņu attēla kontrasts ir vājāks, kas liecina, ka šķidrumam un daļiņām var būt vienāds blīvums un tāpēc tie nevar viegli pārvietoties viens pret otru.Daļiņas var arī iestrēgt, ja magnēts pārvietojas pārāk ātri, norādot, ka magnētiskā lauka stiprums ne vienmēr var pārvarēt berzi starp daļiņām šķidrumā, kas liecina, ka magnētiskā lauka stiprumam un attālumam starp magnētu un mērķa zonu nevajadzētu būt pārsteigums.svarīgs.Šie rezultāti arī norāda, ka, lai gan magnēti var uztvert daudzas mikrodaļiņas, kas plūst caur mērķa zonu, maz ticams, ka var paļauties uz magnētiem, lai pārvietotu CombiMag daļiņas gar trahejas virsmu.Tādējādi mēs secinājām, ka in vivo LV MF pētījumos jāizmanto statiski magnētiskie lauki, lai fiziski mērķētu uz noteiktām elpceļu koka zonām.
Kad daļiņas ir nonākušas ķermenī, tās ir grūti identificēt ķermeņa sarežģīto kustīgo audu kontekstā, taču to noteikšanas spēja ir uzlabota, pārvietojot magnētu horizontāli virs trahejas, lai “izkustinātu” MP stīgas.Lai gan ir iespējama reāllaika attēlveidošana, pēc dzīvnieka humānas nogalināšanas ir vieglāk pamanīt daļiņu kustību.MP koncentrācija parasti bija visaugstākā šajā vietā, kad magnēts tika novietots virs attēlveidošanas zonas, lai gan dažas daļiņas parasti tika atrastas tālāk trahejā.Atšķirībā no in vitro pētījumiem, daļiņas nevar vilkt lejup pa traheju ar magnēta kustību.Šis atklājums atbilst tam, kā gļotas, kas klāj trahejas virsmu, parasti apstrādā ieelpotās daļiņas, notverot tās gļotās un pēc tam notīrot tās caur gļotādas un ciliāru klīrensa mehānismu.
Mēs izvirzījām hipotēzi, ka magnētu izmantošana virs un zem trahejas pievilkšanai (3.b att.) var radīt vienmērīgāku magnētisko lauku, nevis magnētisko lauku, kas ir ļoti koncentrēts vienā punktā, potenciāli radot vienmērīgāku daļiņu sadalījumu..Tomēr mūsu sākotnējais pētījums neatrada skaidrus pierādījumus šīs hipotēzes atbalstam.Līdzīgi, iestatot magnētu pāri atgrūšanai (3.c att.), attēla apgabalā nenosēdās vairāk daļiņu.Šie divi atklājumi parāda, ka divu magnētu iestatīšana būtiski neuzlabo MP norādīšanas vietējo vadību un ka no tā izrietošos spēcīgos magnētiskos spēkus ir grūti noregulēt, padarot šo pieeju mazāk praktisku.Tāpat magnēta orientēšana virs trahejas un pāri tai (3.d attēls) arī nepalielināja attēlotajā apgabalā atlikušo daļiņu skaitu.Dažas no šīm alternatīvajām konfigurācijām var nebūt veiksmīgas, jo to rezultātā samazinās magnētiskā lauka stiprums nogulsnēšanās zonā.Tādējādi viena magnēta konfigurācija 30 grādu leņķī (3.a att.) tiek uzskatīta par vienkāršāko un efektīvāko in vivo testēšanas metodi.
LV-MP pētījums parādīja, ka, kombinējot LV vektorus ar CombiMag un ievadot pēc fiziskiem traucējumiem magnētiskā lauka klātbūtnē, transdukcijas līmenis trahejā ievērojami palielinājās, salīdzinot ar kontrolēm.Pamatojoties uz sinhrotronu attēlveidošanas pētījumiem un LacZ rezultātiem, šķiet, ka magnētiskais lauks spēj noturēt LV trahejā un samazināt vektora daļiņu skaitu, kas nekavējoties iekļuva dziļi plaušās.Šādi mērķauditorijas atlases uzlabojumi var palielināt efektivitāti, vienlaikus samazinot piegādātos titrus, nemērķētu transdukciju, iekaisuma un imūnās blakusparādības un gēnu pārneses izmaksas.Svarīgi, ka saskaņā ar ražotāja teikto CombiMag var izmantot kombinācijā ar citām gēnu pārneses metodēm, tostarp citiem vīrusu vektoriem (piemēram, AAV) un nukleīnskābēm.