Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs atveidosim vietni bez stiliem un JavaScript.
Toxoplasma gondii ir intracelulārs vienšūņu parazīts, kas modulē inficētā saimniekorganisma mikrovidi un, kā zināms, ir saistīts ar smadzeņu audzēja augšanas biežumu.Šajā pētījumā mēs izvirzām hipotēzi, ka eksosomāla miRNS-21 no toksoplazmas infekcijas veicina smadzeņu audzēja augšanu.Tika raksturotas ar toksoplazmu inficētas BV2 mikroglijas eksosomas un apstiprināta U87 gliomas šūnu internalizācija.Eksosomu mikroRNS ekspresijas profili tika analizēti, izmantojot mikroRNS un mikroRNS-21A-5p blokus, kas saistīti ar Toxoplasma gondii un audzēju šķirošanu.Mēs arī pētījām ar audzēju saistīto gēnu mRNS līmeni U87 gliomas šūnās, mainot miR-21 līmeni eksosomās un eksosomu ietekmi uz cilvēka U87 gliomas šūnu proliferāciju.Ar Toxoplasma gondii inficētu U87 gliomas šūnu eksosomās tiek palielināta mikroRNS-21 ekspresija un samazināta pretvēža gēnu (FoxO1, PTEN un PDCD4) aktivitāte.No BV2 iegūtās eksosomas, kas inficētas ar toksoplazmu, izraisa U87 gliomas šūnu proliferāciju.Eksosomas inducē U87 šūnu augšanu peles audzēja modelī.Mēs ierosinām, ka palielināts eksosomālais miR-21 toksoplazmas inficētajā BV2 mikroglijā var spēlēt svarīgu lomu kā šūnu augšanas veicinātājs U87 gliomas šūnās, samazinot pretvēža gēnus.
Tiek lēsts, ka 2018. gadā visā pasaulē tika diagnosticēts vairāk nekā 18,1 miljons progresējoša vēža gadījumu, un katru gadu tiek diagnosticēti aptuveni 297 000 centrālās nervu sistēmas audzēju (1,6% no visiem audzējiem)1.Iepriekšējie pētījumi liecina, ka cilvēka smadzeņu audzēju attīstības riska faktori ietver dažādus ķīmiskos produktus, ģimenes vēsturi un jonizējošo starojumu no galvas terapeitiskajām un diagnostikas iekārtām.Tomēr precīzs šo ļaundabīgo audzēju cēlonis nav zināms.Apmēram 20% no visiem vēža gadījumiem pasaulē izraisa infekcijas izraisītāji, tostarp vīrusi, baktērijas un parazīti3,4.Infekcijas patogēni izjauc saimniekšūnas ģenētiskos mehānismus, piemēram, DNS atjaunošanos un šūnu ciklu, un var izraisīt hronisku iekaisumu un imūnsistēmas bojājumus5.
Ar cilvēka vēzi saistītie infekcijas izraisītāji ir visizplatītākie vīrusu patogēni, tostarp cilvēka papilomas vīrusi un B un C hepatīta vīrusi.Parazītiem var būt arī potenciāla loma cilvēka vēža attīstībā.Vairākas parazītu sugas, proti, Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis un Hymenolepis nana, ir saistītas ar dažāda veida cilvēka vēzi 6,7,8.
Toxoplasma gondii ir intracelulārs vienšūnis, kas regulē inficēto saimniekšūnu mikrovidi.Tiek lēsts, ka šis parazīts inficē aptuveni 30% pasaules iedzīvotāju, pakļaujot riskam visu iedzīvotāju skaitu9,10.Toxoplasma gondii var inficēt dzīvībai svarīgus orgānus, tostarp centrālo nervu sistēmu (CNS), un izraisīt nopietnas slimības, piemēram, letālu meningītu un encefalītu, īpaši pacientiem ar imūndeficītu9.Tomēr Toxoplasma gondii var arī mainīt inficētā saimnieka vidi, modulējot šūnu augšanu un imūnās atbildes reakcijas imūnkompetentiem indivīdiem, izraisot asimptomātiskas hroniskas infekcijas saglabāšanos9,11.Interesanti, ka, ņemot vērā korelāciju starp T. gondii izplatību un smadzeņu audzēju sastopamību, daži ziņojumi liecina, ka in vivo saimniekorganisma vides izmaiņas hroniskas T. gondii infekcijas dēļ līdzinās audzēja mikrovidei.
Eksosomas ir pazīstamas kā starpšūnu komunikatori, kas piegādā bioloģisko saturu, tostarp olbaltumvielas un nukleīnskābes, no blakus esošajām šūnām16, 17.Eksosomas var ietekmēt ar audzēju saistītos bioloģiskos procesus, piemēram, anti-apoptozi, angiogenēzi un metastāzes audzēja mikrovidē.Jo īpaši miRNS (miRNS), mazas nekodējošas RNS, kuru garums ir aptuveni 22 nukleotīdi, ir svarīgi pēctranskripcijas gēnu regulatori, kas kontrolē vairāk nekā 30% cilvēka mRNS, izmantojot miRNS izraisītu trokšņa slāpēšanas kompleksu (miRISC).Toxoplasma gondii var izjaukt bioloģiskos procesus, kontrolējot miRNS ekspresiju inficētajos saimniekos.Saimnieka miRNS satur svarīgus signālus saimnieka bioloģisko procesu regulēšanai, lai sasniegtu parazīta izdzīvošanas stratēģiju.Tādējādi saimnieka miRNS profila izmaiņu izpēte pēc inficēšanās ar T. gondii var palīdzēt mums skaidrāk izprast mijiedarbību starp saimniekorganismu un T. gondii.Patiešām, Thirugnanam et al.15 ierosināja, ka T. gondii veicina smadzeņu kanceroģenēzi, mainot tās ekspresiju uz specifiskām saimnieka miRNS, kas saistītas ar audzēja augšanu, un konstatēja, ka T. gondii var izraisīt gliomas eksperimentālajiem dzīvniekiem.
Šis pētījums koncentrējas uz eksosomālā miR-21 izmaiņām saimniekorganisma mikroglijā, kas inficēts ar Toxoplasma BV2.Mēs novērojām izmainīta eksosomāla miR-21 iespējamo lomu U87 gliomas šūnu augšanā FoxO1 / p27 aiztures dēļ, kas ir pārmērīgi ekspresētā miR-21 mērķis.
Eksosomas, kas iegūtas no BV2, tika iegūtas, izmantojot diferenciālu centrifugēšanu, un apstiprinātas ar dažādām metodēm, lai novērstu piesārņojumu ar šūnu komponentiem vai citiem pūslīšiem.SDS-poliakrilamīda gēla elektroforēze (SDS-PAGE) parādīja atšķirīgus modeļus starp proteīniem, kas ekstrahēti no BV2 šūnām un eksosomām (1.A attēls), un paraugos tika novērtēta Alix klātbūtne, kas tika analizēta ar eksosomu proteīnu marķieru Western blotēšanu .Alix marķējums tika konstatēts eksosomu proteīnos, bet ne BV2 šūnu lizāta proteīnos (1.B att.).Turklāt, izmantojot bioanalizatoru, tika analizēta attīrīta RNS no eksosomām, kas iegūtas no BV2.18S un 28S ribosomu apakšvienības tika reti novērotas eksosomu RNS migrācijas modelī, kas norāda uz ticamu tīrību (1. C attēls).Visbeidzot, transmisijas elektronu mikroskopija parādīja, ka novērotās eksosomas bija aptuveni 60–150 nm lielas un tām bija eksosomu morfoloģijai raksturīga krūzei līdzīga struktūra (1. att. D).
No BV2 šūnām iegūto eksosomu raksturojums.(A) Drošības datu lapas lapa.Olbaltumvielas tika izolētas no BV2 šūnām vai eksosomām, kas iegūtas no BV2.Olbaltumvielu modeļi šūnās un eksosomās atšķiras.(B) Eksosomālā marķiera (Alix) Western blot analīze.(C) Attīrītas RNS novērtēšana no BV2 šūnām un BV2 atvasinātām eksosomām, izmantojot bioanalizatoru.Tādējādi 18S un 28S ribosomu apakšvienības BV2 šūnās reti tika atrastas eksosomālajā RNS.(D) Transmisijas elektronu mikroskopija parādīja, ka eksosomas, kas izolētas no BV2 šūnām, tika negatīvi iekrāsotas ar 2% uranilacetātu.Eksosomas ir aptuveni 60–150 nm lielas un kausa formas (Song un Jung, nepublicēti dati).
Izmantojot konfokālo mikroskopiju, tika novērota BV2 iegūto eksosomu šūnu internalizācija U87 cilvēka gliomas šūnās.Ar PKH26 iezīmētās eksosomas ir lokalizētas U87 šūnu citoplazmā.Kodoli tika iekrāsoti ar DAPI (2. att. A), kas norāda, ka no BV2 iegūtās eksosomas var internalizēt saimniekšūnas un ietekmēt saņēmēju šūnu vidi.
No BV2 atvasināto eksosomu internalizācija U87 gliomas šūnās un no BV2 atvasinātās eksosomās, kas inficētas ar Toxoplasma RH, izraisīja U87 gliomas šūnu proliferāciju.(A) U87 šūnu pārņemtās eksosomas, ko mēra ar konfokālo mikroskopiju.U87 gliomas šūnas 24 stundas inkubēja ar eksosomām, kas marķētas ar PKH26 (sarkans) vai bez kontroles.Kodolus iekrāsoja ar DAPI (zilu) un pēc tam novēroja konfokālā mikroskopā (mēroga josla: 10 μm, x 3000).(B) U87 gliomas šūnu proliferācija tika noteikta ar šūnu proliferācijas testu.U87 gliomas šūnas tika apstrādātas ar eksosomām norādīto laiku. *P < 0,05 tika iegūts ar Stjudenta t testu. *P < 0,05 tika iegūts ar Stjudenta t testu. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0,05 pēc Stjudenta t-testa. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 iegūts, izmantojot Stjudenta t-testu.
Pēc tam, kad tika apstiprināta no BV2 atvasināto eksosomu internalizācija U87 gliomas šūnās, mēs veicām šūnu proliferācijas testus, lai izpētītu no BV2 atvasināto toksoplazmas atvasināto eksosomu lomu cilvēka gliomas šūnu attīstībā.U87 šūnu apstrāde ar eksosomām no T. gondii inficētām BV2 šūnām parādīja, ka ar T. gondii inficētās BV2 atvasinātās eksosomas izraisīja ievērojami lielāku U87 šūnu proliferāciju, salīdzinot ar kontroli (2.B att.).
Turklāt U118 šūnu augšanai bija tādi paši rezultāti kā U87, jo toksoplazmas stimulētās eksosomas izraisīja visaugstāko proliferācijas līmeni (dati nav parādīti).Pamatojoties uz šiem datiem, mēs varam norādīt, ka no BV2 atvasinātām toksoplazmas inficētām eksosomām ir svarīga loma gliomas šūnu proliferācijā.
Lai izpētītu ar toksoplazmu inficēto BV2 atvasināto eksosomu ietekmi uz audzēja attīstību, mēs injicējām U87 gliomas šūnas plikām pelēm ksenotransplantāta modelim un injicējām no BV2 atvasinātas eksosomas vai ar RH inficētas BV2 atvasinātas eksosomas.Kad audzēji kļuva pamanāmi pēc 1 nedēļas, katra eksperimentālā 5 peļu grupa tika sadalīta atbilstoši audzēja izmēram, lai noteiktu to pašu sākumpunktu, un audzēja lielums tika mērīts 22 dienas.
Pelēm ar U87 ksenotransplantāta modeli 22. dienā ar BV2 iegūto RH inficēto eksosomu grupā tika novērots ievērojami lielāks audzēja izmērs un svars (3.A un B att.).No otras puses, pēc eksosomu apstrādes nebija būtiskas atšķirības audzēja lielumā starp BV2 iegūto eksosomu grupu un kontroles grupu.Turklāt pelēm, kurām tika injicētas gliomas šūnas un eksosomas, vizuāli bija vislielākais audzēja tilpums ar RH inficēto BV2 eksosomu grupā (3. C attēls).Šie rezultāti parāda, ka BV2 atvasinātās toksoplazmas inficētās eksosomas izraisa gliomas augšanu peles audzēja modelī.
No BV2 iegūto eksosomu onkoģenēze (AC) U87 ksenotransplantāta peles modelī.Audzēja izmērs (A) un svars (B) ievērojami palielinājās BALB/c plikajām pelēm, kuras tika ārstētas ar RH inficētām eksosomām, kas iegūtas no BV2.BALB/c plikajām pelēm (C) subkutāni injicēja 1 x 107 U87 šūnas, kas suspendētas Matrigel maisījumā.Sešas dienas pēc injekcijas pelēm tika apstrādātas 100 μg no BV2 iegūtas eksosomas.Audzēja lielums un svars tika mērīti attiecīgi norādītajās dienās un pēc nogalināšanas. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *P < 0,05. *Р < 0,05. *P < 0,05.
Dati parādīja, ka 37 miRNS (16 pārmērīgi ekspresētas un 21 samazinātas), kas saistītas ar imunitāti vai audzēja attīstību, tika būtiski mainītas mikroglijā pēc inficēšanās ar Toxoplasma RH celmu (4.A att.).MiR-21 relatīvie ekspresijas līmeņi starp mainītajām miRNS tika apstiprināti ar reāllaika RT-PCR eksosomās, kas iegūtas no BV2, eksosomām, kas apstrādātas ar BV2 un U87 šūnām.MiR-21 ekspresija uzrādīja ievērojamu eksosomu pieaugumu no BV2 šūnām, kas inficētas ar Toxoplasma gondii (RH celmu) (4.B att.).Relatīvais miR-21 ekspresijas līmenis BV2 un U87 šūnās palielinājās pēc izmainītu eksosomu uzņemšanas (4.B att.).Relatīvais miR-21 ekspresijas līmenis smadzeņu audos pacientiem ar audzēju un pelēm, kas inficētas ar Toxoplasma gondii (ME49 celms), bija augstāks nekā kontroles grupās (4. att. C).Šie rezultāti korelē ar atšķirībām starp prognozēto un apstiprināto mikroRNS ekspresijas līmeņiem in vitro un in vivo.
Eksosomālās miP-21a-5p ekspresijas izmaiņas mikroglijās, kas inficētas ar Toxoplasma gondii (RH).(A) Uzrāda būtiskas izmaiņas siRNS, kas saistītas ar imunitāti vai audzēja attīstību pēc T. gondii RH infekcijas.(B) Relatīvie miR-21 ekspresijas līmeņi tika noteikti ar reāllaika RT-PCR BV2 iegūtajās eksosomās, ar BV2 apstrādātās eksosomās un U87 šūnās.(C) Relatīvie miR-21 ekspresijas līmeņi tika konstatēti audzēja pacientu (N = 3) un ar Toxoplasma gondii (ME49 celmu) inficētu peļu smadzeņu audos (N = 3). *P < 0,05 tika iegūts ar Stjudenta t testu. *P < 0,05 tika iegūts ar Stjudenta t testu. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 tika iegūts, izmantojot Stjudenta t-testu. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 iegūts, izmantojot Stjudenta t-testu.
Eksosomas no RH inficētām BV2 šūnām izraisīja gliomu augšanu in vivo un in vitro (2., 3. att.).Lai noteiktu atbilstošās mRNS, mēs pārbaudījām pretvēža mērķa gēnu mRNS līmeni, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN un ieprogrammēto šūnu nāvi 4 (PDCD4) U87 šūnās, kas inficētas ar eksosomām, kas iegūtas no BV2 vai RH BV2.Bioinformātikas analīze ir parādījusi, ka vairākiem ar audzējiem saistītiem gēniem, tostarp FoxO1, PTEN un PDCD4 gēniem, ir saistīšanās vietas miR-2121,22.Pretvēža mērķa gēnu mRNS līmenis tika samazināts ar RH inficētām BV2 eksosomām, salīdzinot ar BV2 atvasinātajām eksosomām (5.A att.).FoxO1 uzrādīja samazinātu proteīna līmeni RH inficētajās BV2 eksosomās, salīdzinot ar BV2 iegūtajām eksosomām (5.B attēls).Pamatojoties uz šiem rezultātiem, mēs varētu apstiprināt, ka eksosomas, kas iegūtas no RH inficēta BV2, samazina anti-onkogēno gēnu regulēšanu, saglabājot to lomu audzēja augšanā.
Ar toksoplazmas RH inficētās BV2 atvasinātās eksosomas inducē pretvēža gēnu nomākšanu U87 gliomas šūnās ar Toxoplasma RH inficētām BV2 eksosomām.(A) FoxO1, PTEN un PDCD4 ekspresijas reāllaika PCR eksosomās, kas iegūtas no T. gondii RH inficētas BV2, salīdzinot ar PBS eksosomām.β-aktīna mRNS tika izmantota kā kontrole.(B) FoxO1 ekspresija tika noteikta ar Western blot metodi, un densitometrijas dati tika statistiski novērtēti, izmantojot ImageJ programmu. *P < 0,05 tika iegūts ar Stjudenta t testu. *P < 0,05 tika iegūts ar Stjudenta t testu. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P < 0,05 tika iegūts, izmantojot Stjudenta t-testu. *P < 0,05 通过学生t 检验获得. *P < 0,05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0,05 iegūts, izmantojot Stjudenta t-testu.
Lai saprastu miP-21 ietekmi uz eksosomām uz audzēju saistīto gēnu regulēšanu, U87 šūnas tika transficētas ar miP-21 inhibitoru, izmantojot Lipofectamine 2000, un šūnas tika novāktas 24 stundas pēc transfekcijas.FoxO1 un p27 ekspresijas līmeņi šūnās, kas transficētas ar miR-21 inhibitoriem, tika salīdzinātas ar šūnām, kas apstrādātas ar BV2 atvasinātām eksosomām, izmantojot qRT-PCR (6.A, B att.).MiR-21 inhibitora transfekcija U87 šūnās ievērojami samazināja FoxO1 un p27 ekspresiju (6. attēls).
RH inficēts eksosomāls BV2 iegūtais miP-21 mainīja FoxO1 / p27 ekspresiju U87 gliomas šūnās.U87 šūnas tika transficētas ar miP-21 inhibitoru, izmantojot Lipofectamine 2000, un šūnas tika novāktas 24 stundas pēc transfekcijas.FoxO1 un p27 ekspresijas līmeņi šūnās, kas transficētas ar miR-21 inhibitoriem, tika salīdzinātas ar līmeņiem šūnās, kas apstrādātas ar BV2 atvasinātām eksosomām, izmantojot qRT-PCR (A, B).
Lai izvairītos no saimnieka imūnās atbildes, Toxoplasma parazīts pārvēršas audu cistā.Viņi parazitē dažādos audos, tostarp smadzenēs, sirdī un skeleta muskuļos, visā saimnieka dzīves laikā un modulē saimnieka imūnreakciju.Turklāt tie var regulēt šūnu ciklu un saimniekšūnu apoptozi, veicinot to proliferāciju14,24.Toxoplasma gondii pārsvarā inficē saimnieka dendrītiskās šūnas, neitrofilus un monocītu/makrofāgu ciltsrakstus, tostarp smadzeņu mikrogliju.Toxoplasma gondii izraisa M2 fenotipa makrofāgu diferenciāciju, ietekmē brūču dzīšanu pēc patogēna infekcijas, kā arī ir saistīta ar hipervaskularizāciju un granulomatozo fibrozi.Šī toksoplazmas infekcijas uzvedības patoģenēze var būt saistīta ar marķieriem, kas saistīti ar audzēja attīstību.Toksoplazmas regulētā naidīgā vide var atgādināt atbilstošo pirmsvēža audzēju.Tāpēc var pieņemt, ka toksoplazmas infekcijai vajadzētu veicināt smadzeņu audzēju attīstību.Faktiski ir ziņots par augstu toksoplazmas infekcijas līmeni pacientu ar dažādiem smadzeņu audzējiem serumā.Turklāt Toxoplasma gondii var būt vēl viens kancerogēns efektors un darboties sinerģiski, lai palīdzētu citiem infekcioziem kancerogēniem attīstīt smadzeņu audzējus.Šajā sakarā ir vērts atzīmēt, ka P. falciparum un Epstein-Barr vīruss sinerģiski veicina Burkitta limfomas veidošanos.
Eksosomu kā regulatoru loma vēža izpētes jomā ir plaši pētīta.Tomēr eksosomu loma starp parazītiem un inficētiem saimniekiem joprojām ir slikti izprotama.Līdz šim dažādi regulatori, tostarp izdalītās olbaltumvielas, ir izskaidrojuši bioloģiskos procesus, ar kuriem vienšūņu parazīti pretojas saimnieka uzbrukumam un iemūžina infekciju.Pēdējā laikā pieaug koncepcija, ka ar vienšūņiem saistītās mikrovezikulas un to mikroRNS mijiedarbojas ar saimniekšūnām, lai radītu labvēlīgu vidi to izdzīvošanai.Tāpēc ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai atklātu saistību starp izmainītām eksosomu miRNS un gliomas šūnu proliferāciju.MikroRNS izmaiņas (klasteru gēni miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 un miR-17-92) saistās ar STAT3 promotoru toksoplazmas inficētos cilvēka makrofāgos, tiek regulētas un inducē anti. -apoptoze, reaģējot uz Toxoplasma gondii infekciju 29 .Toksoplazmas infekcija palielina miR-17-5p un miR-106b-5p ekspresiju, kas ir saistītas ar vairākām hiperproliferatīvām slimībām30.Šie dati liecina, ka saimnieka miRNS, ko regulē Toxoplasma infekcija, ir svarīgas molekulas parazītu izdzīvošanai un patoģenēzei saimniekorganisma bioloģiskajā uzvedībā.
Izmainītas miRNS var ietekmēt dažāda veida uzvedību ļaundabīgo šūnu, tostarp gliomu, ierosināšanas un progresēšanas laikā: augšanas signālu pašpietiekamība, nejutīgums pret augšanu kavējošiem signāliem, izvairīšanās no apoptozes, neierobežots replikācijas potenciāls, angioģenēze, invāzija un metastāzes, kā arī iekaisums.Gliomā vairākos ekspresijas profilēšanas pētījumos ir identificētas izmainītas miRNS.
Šajā pētījumā mēs apstiprinājām augstu miRNS-21 ekspresijas līmeni toksoplazmas inficētajās saimniekšūnās.miR-21 ir identificēts kā viena no visbiežāk pārmērīgi ekspresētajām mikroRNS cietos audzējos, tostarp gliomās, un tā ekspresija korelē ar gliomas pakāpi.Uzkrājošie pierādījumi liecina, ka miR-21 ir jauns onkogēns, kas darbojas kā anti-apoptotisks faktors gliomas augšanā un ir ļoti pārmērīgi ekspresēts cilvēka smadzeņu ļaundabīgo audzēju audos un plazmā.Interesanti, ka miR-21 inaktivācija gliomas šūnās un audos izraisa šūnu proliferācijas kavēšanu no kaspāzes atkarīgas apoptozes dēļ.MiR-21 paredzēto mērķu bioinformātiskā analīze atklāja vairākus audzēja nomācošos gēnus, kas saistīti ar apoptozes ceļiem, tostarp ieprogrammētu šūnu nāvi 4 (PDCD4), tropomiozīnu (TPM1), PTEN un dakšas kārbu O1 (FoxO1), ar miR-2121 saistīšanās vietu..22.38.
FoxO1 kā viens no transkripcijas faktoriem (FoxO) ir iesaistīts dažādu cilvēka vēža veidu attīstībā un var regulēt audzēju nomācošo gēnu, piemēram, p21, p27, Bim un FasL40, ekspresiju.FoxO1 var saistīt un aktivizēt šūnu cikla inhibitorus, piemēram, p27, lai nomāktu šūnu augšanu.Turklāt FoxO1 ir galvenais PI3K / Akt signalizācijas efektors un regulē daudzus bioloģiskos procesus, piemēram, šūnu cikla progresēšanu un šūnu diferenciāciju, aktivizējot p2742 transkripciju.
Noslēgumā mēs uzskatām, ka eksosomālajam miR-21, kas iegūts no toksoplazmas inficētas mikroglijas, var būt svarīga loma kā gliomas šūnu augšanas regulatoram (7. att.).Tomēr ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai atrastu tiešu saikni starp eksosomālo miR-21, izmainīto toksoplazmas infekciju un gliomas augšanu.Paredzams, ka šie rezultāti būs sākumpunkts, lai pētītu saistību starp toksoplazmas infekciju un gliomas sastopamību.
Šajā pētījumā ir piedāvāta gliomas (smadzeņu) kanceroģenēzes mehānisma shematiska diagramma.Autors zīmē programmā PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Visi eksperimentālie protokoli šajā pētījumā, tostarp dzīvnieku izmantošana, bija saskaņā ar Seulas Nacionālās universitātes Dzīvnieku kopšanas un lietotāju komitejas standarta ētikas vadlīnijām, un tos apstiprināja Seulas Nacionālās universitātes Medicīnas skolas Institucionālā pārskata padome (IRB numurs SNU- 150715).-2).Visas eksperimentālās procedūras tika veiktas saskaņā ar ARRIVE ieteikumiem.
BV2 peles mikroglijas un U87 cilvēka gliomas šūnas tika kultivētas attiecīgi Dulbecco modificētajā ērgļa barotnē (DMEM; Welgene, Seula, Koreja) un Roswell Park Memorial Institute barotnē (RPMI; Welgene), katra saturēja 10% liellopu augļa seruma, 4 mM l- glutamīns, 0,2 mM penicilīns un 0,05 mM streptomicīns.Šūnas tika kultivētas inkubatorā ar 5% CO2 37 ° C temperatūrā.Salīdzināšanai ar U87 šūnām tika izmantota cita gliomas šūnu līnija U118.
Lai izolētu eksosomas no ar T. gondii inficētiem RH un ME49 celmiem, T. gondii tachyzoites (RH celms) ievāca no vēdera dobuma 6 nedēļas vecām BALB/c pelēm, kas tika injicētas 3–4 dienas iepriekš.Tahizoīti tika mazgāti trīs reizes ar PBS un attīrīti, centrifugējot 40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV)43.Lai iegūtu ME49 celma tahizoītus, BALB/c pelēm intraperitoneāli injicēja 20 audu cistas un tahizoīta transformāciju cistās savāca, mazgājot vēdera dobumu 6.–8. dienā pēc inficēšanās (PI).Peles, kas inficētas ar PBS.ME49 tahizoīti tika audzēti šūnās, kas papildinātas ar 100 μg/ml penicilīnu (Gibco/BRL, Grand Island, NY, ASV), 100 μg/ml streptomicīnu (Gibco/BRL) un 5% liellopu augļa serumu (Lonza, Walkersville, MD). .., ASV) 37 °C temperatūrā un 5% oglekļa dioksīda.Pēc kultivēšanas Vero šūnās ME49 tahizoīti tika izlaisti divreiz caur 25 gabarīta adatu un pēc tam caur 5 µm filtru, lai noņemtu gružus un šūnas.Pēc mazgāšanas tahizoīti tika atkārtoti suspendēti PBS44.Toxoplasma gondii celma ME49 audu cistas tika uzturētas, intraperitoneāli injicējot cistas, kas izolētas no inficētu C57BL/6 peļu smadzenēm (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Koreja).Ar ME49 inficēto peļu smadzenes tika novāktas pēc 3 mēnešu PI un sasmalcinātas mikroskopā, lai izolētu cistas.Inficētās peles tika turētas īpašos bez patogēniem apstākļos (SPF) Seulas Nacionālās universitātes Medicīnas skolā.
Kopējā RNS tika ekstrahēta no BV2 atvasinātām eksosomām, BV2 šūnām un audiem, izmantojot miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Vācija) saskaņā ar ražotāja norādījumiem, ieskaitot inkubācijas laiku eluēšanas posmam.RNS koncentrācija tika noteikta ar NanoDrop 2000 spektrofotometru.RNS mikromasīvu kvalitāte tika novērtēta, izmantojot Agilent 2100 bioanalizatoru (Agilent Technologies, Amstelveen, Nīderlande).
DMEM ar 10% eksosomu nabadzīgu FBS tika sagatavots, ultracentrifugējot pie 100 000 g 16 stundas 4 ° C temperatūrā un filtrēts caur 0, 22 µm filtru (Nalgene, Rochester, NY, ASV).BV2 šūnas, 5 × 105, tika kultivētas DMEM, kas satur 10% eksosomu noplicinātu FBS un 1% antibiotiku 37 ° C temperatūrā un 5% CO2.Pēc 24 stundu inkubācijas šūnām tika pievienoti celma RH vai ME49 tahizoīti (MOI = 10), un neinvazējošie parazīti tika noņemti stundas laikā un atkārtoti piepildīti ar DMEM.Eksosomas no BV2 šūnām tika izolētas ar modificētu diferenciālo centrifugēšanu, kas ir visplašāk izmantotā metode.RNS vai olbaltumvielu analīzei atkārtoti suspendējiet eksosomu granulu 300 µl PBS.Izolēto eksosomu koncentrācija tika noteikta, izmantojot BCA proteīna testa komplektu (Pierce, Rockford, IL, ASV) un NanoDrop 2000 spektrofotometru.
Nogulsnes no BV2 šūnām vai eksosomas, kas iegūtas no BV2, tika lizētas PRO-PREP™ proteīna ekstrakcijas šķīdumā (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea), un olbaltumvielas tika ielādētas Coomassie izcili zilos krāsotos 10% SDS poliakrilamīda gēlos.Turklāt olbaltumvielas 2 stundas tika pārnestas uz PVDF membrānām.Western bloti tika apstiprināti, izmantojot Alix antivielu (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, ASV) kā eksosomālu marķieri.Kā sekundārā antiviela tika izmantots HRP konjugēts kazas anti-peles IgG (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, ASV) un LAS-1000 plus luminiscējoša attēla analizators (Fuji Photography Film, Tokija, Japāna)..Lai izpētītu eksosomu izmēru un morfoloģiju, tika veikta transmisijas elektronu mikroskopija.Eksosomas, kas izolētas no BV2 šūnām (6, 40 µg / µl), tika sagatavotas uz ar oglekli pārklātām acīm un negatīvi iekrāsotas ar 2% uranilacetātu 1 minūti.Sagatavotie paraugi tika novēroti ar paātrinājuma spriegumu 80 kV, izmantojot JEOL 1200-EX II (Tokija, Japāna), kas aprīkots ar ES1000W Erlangshen CCD kameru (Gatana, Pleasanton, CA, ASV).
No BV2 iegūtās eksosomas tika krāsotas, izmantojot PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV) 15 minūtes istabas temperatūrā.U87 šūnas, 2 × 105, ar PKH26 iezīmētām eksosomām (sarkanām) vai bez eksosomām kā negatīvu kontroli, 24 stundas inkubēja 37 ° C temperatūrā 5% CO2 inkubatorā.U87 šūnu kodoli tika iekrāsoti ar DAPI (zilu), U87 šūnas tika fiksētas 4% paraformaldehīdā 15 minūtes 4 ° C temperatūrā un pēc tam analizētas Leica TCS SP8 STED CW konfokālā mikroskopa sistēmā (Leica Microsystems, Manheima, Vācija).novērojams.
cDNS tika sintezēta no siRNS, izmantojot Mir-X siRNA pirmās virknes sintēzi un SYBR qRT-PCR komplektu (Takara Bio Inc., Shiga, Japāna).Reālā laika kvantitatīvā PCR tika veikta, izmantojot iQ5 reālā laika PCR noteikšanas sistēmu (Bio-Rad, Hercules, CA, ASV), izmantojot primerus un veidnes, kas sajauktas ar SYBR Premix.DNS tika amplificēta 40 denaturācijas cikliem 95 ° C temperatūrā 15 sekundes un atkvēlināšanai 60 ° C temperatūrā 60 sekundes.Katras PCR reakcijas dati tika analizēti, izmantojot iQ™5 optiskās sistēmas programmatūras (Bio-Rad) datu analīzes moduli.Relatīvās izmaiņas gēnu ekspresijā starp atlasītajiem mērķa gēniem un β-aktīnu/siRNS (un U6) tika aprēķinātas, izmantojot standarta līknes metodi.Izmantotās primeru sekvences ir parādītas 1. tabulā.
3 x 104 U87 gliomas šūnas tika iesētas 96 bedrīšu plāksnēs un sajauktas ar toksoplazmu inficētām eksosomām, kas iegūtas no BV2 (50 μg/ml) vai nepulsa eksosomām, kas iegūtas no BV2 (50 μg/ml), kā kontroles 12., 18. un 36. stundās. .Šūnu proliferācijas ātrums tika noteikts, izmantojot šūnu skaitīšanas komplektu-8 (Dojindo, Kumamoto, Japāna) (papildu attēli S1-S3) 46 .
5 nedēļas vecas BALB/c kailās peles mātītes tika iegādātas no Orient Bio (Seongnam-si, Dienvidkoreja) un tika turētas atsevišķi sterilos būros istabas temperatūrā (22±2°C) un mitrumā (45±15°C).%) istabas temperatūrā (22±2°C) un mitrumā (45±15%).12 stundu gaismas cikls un 12 stundu tumšais cikls tika veikts saskaņā ar SPF (Seulas Nacionālās universitātes Medicīnas skolas dzīvnieku centrs).Peles tika nejauši sadalītas trīs grupās pa 5 pelēm katrā, un visām grupām subkutāni injicēja 400 ml PBS, kas satur 1 x 107 U87 gliomas šūnas un samazināja augšanas faktoru BD Matrigel™ (BD Science, Maiami, FL, ASV).Sešas dienas pēc audzēja injekcijas audzēja vietā tika injicēts 200 mg eksosomu, kas iegūtas no BV2 šūnām (ar/bez toksoplazmas infekcijas).Divdesmit divas dienas pēc audzēja inficēšanās peļu audzēja lielums katrā grupā tika mērīts ar suportu trīs reizes nedēļā, un audzēja tilpums tika aprēķināts pēc formulas: 0, 5 × (platums) × 2 × garums.
MikroRNS ekspresijas analīze, izmantojot miRCURYTM LNA miRNS masīvu, 7. paaudze ir, mmu un rno masīvi (EXIQON, Vedbaek, Dānija), kas aptver 1119 labi raksturotas peles starp 3100 cilvēku, peļu un žurku miRNS uztveršanas zondēm.Šīs procedūras laikā no 5'-fosfāta tika noņemti 250 līdz 1000 ng kopējās RNS, apstrādājot ar teļa zarnu sārmaino fosfatāzi, kam sekoja marķēšana ar Hy3 zaļo fluorescējošo krāsu.Pēc tam marķētie paraugi tika hibridizēti, ielādējot mikroarray priekšmetstikliņus, izmantojot hibridizācijas kameras komplektu (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV) un hibridizācijas priekšmetstikliņu komplektu (Agilent Technologies).Hibridizācija tika veikta 16 stundas 56 ° C temperatūrā, pēc tam mikromasīvi tika mazgāti saskaņā ar ražotāja ieteikumiem.Pēc tam apstrādātie mikromasīvu priekšmetstikliņi tika skenēti, izmantojot Agilent G2565CA mikromasīvu skeneru sistēmu (Agilent Technologies).Skenētie attēli tika importēti, izmantojot programmatūras Agilent Feature Extraction versiju 10.7.3.1 (Agilent Technologies), un katra attēla fluorescences intensitāte tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot modificētā Exiqon protokola atbilstošo GAL failu.Pašreizējā pētījuma mikromasīvu dati tiek deponēti GEO datu bāzē ar pievienošanās numuru GPL32397.
Nobriedušu eksosomu miRNS ekspresijas profili RH vai ME49 celmu mikroglijās, kas inficēti ar Toxoplasma, tika analizēti, izmantojot dažādus tīkla rīkus.Ar audzēja attīstību saistītās miRNS tika identificētas, izmantojot miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) un filtrētas ar normalizētu signāla intensitāti (log2), kas lielāka par 8, 0.Starp miRNS tika konstatēts, ka diferenciāli ekspresētās miRNS ir vairāk nekā 1,5 reizes izmainītas, veicot miRNS filtru analīzi, ko izmainīja RH vai ME49 celmi, kas inficēti ar T. gondii.
Šūnas tika iesētas sešu iedobju plāksnēs (3 x 105 šūnas uz iedobi) opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, ASV), izmantojot Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ASV).Transfektētās šūnas tika kultivētas 6 stundas, un pēc tam barotne tika nomainīta uz svaigu pilnīgu barotni.Šūnas tika novāktas 24 stundas pēc transfekcijas.
Statistiskā analīze galvenokārt tika veikta, izmantojot Studenta t-testu ar Excel programmatūru (Microsoft, Vašingtona, DC, ASV).Eksperimentālai dzīvnieku analīzei tika veikta divvirzienu ANOVA, izmantojot Prism 3.0 programmatūru (GraphPad Software, La Jolla, CA, ASV). P vērtības < 0,05 tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām. P vērtības < 0,05 tika uzskatītas par statistiski nozīmīgiem. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P vērtības <0,05 tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām. P 值< 0,05 被认为具有统计学意义. P 值< 0,05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. P vērtības <0,05 tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām.
Visus šajā pētījumā izmantotos eksperimentālos protokolus apstiprināja Seulas Nacionālās universitātes Medicīnas skolas Institucionālā pārskata padome (IRB numurs SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Paredzamā vēža sastopamība un mirstība pasaulē 2018. gadā: GLOBOCAN avoti un metodes.Interpretācija.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Ieskats smadzeņu audzēju riska faktoros un to terapeitiskajās iejaukšanās. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Ieskats smadzeņu audzēju riska faktoros un to terapeitiskajās iejaukšanās.Rashid, S., Rehman, K. un Akash, MS Pārskats par riska faktoriem smadzeņu audzējiem un galvenajiem terapeitiskajiem pasākumiem. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Padziļināta izpratne par smadzeņu audzēju riska faktoriem un terapeitiskām iejaukšanās metodēm.Rashid, S., Rehman, K. un Akash, MS Pārskats par riska faktoriem smadzeņu audzējiem un galvenajiem terapeitiskajiem pasākumiem.Biomedicīnas zinātne.Farmaceits.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Baktēriju un vīrusu mijiedarbība cilvēka orodigestive un sieviešu dzimumorgānu trakta vēža gadījumā: epidemioloģisko un laboratorijas pierādījumu kopsavilkums. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Baktēriju un vīrusu mijiedarbība cilvēka orodigestive un sieviešu dzimumorgānu trakta vēža gadījumā: epidemioloģisko un laboratorijas pierādījumu kopsavilkums.Kato I., Zhang J. un Sun J. Baktēriju un vīrusu mijiedarbība cilvēka kuņģa-zarnu trakta un sieviešu dzimumorgānu vēža gadījumā: epidemioloģisko un laboratorijas datu kopsavilkums. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.据总结. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Baktēriju un vīrusu mijiedarbība cilvēka mutes dobuma gremošanā un sieviešu reproduktīvajā traktā: tautas slimību zinātnes un laboratorijas pierādījumu kopsavilkums.Kato I., Zhang J. un Sun J. Baktēriju un vīrusu mijiedarbība cilvēka kuņģa-zarnu trakta vēža un sieviešu dzimumorgānu vēža gadījumā: epidemioloģisko un laboratorijas datu kopsavilkums.Cancer 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL No infekcijas līdz vēzim: kā DNS audzēja vīrusi maina saimniekšūnu centrālās oglekļa un lipīdu metabolismu. Magon, KL & Parish, JL No infekcijas līdz vēzim: kā DNS audzēja vīrusi maina saimniekšūnu centrālās oglekļa un lipīdu metabolismu.Mahon, KL un Parish, JL Ugunsdrošība pret vēzi: kā uz DNS balstīti audzēja vīrusi maina saimniekšūnu centrālās oglekļa un lipīdu metabolismu. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNS 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质仂 Magon, KL & Parish, JL No infekcijas līdz vēzim: kā DNS audzēja vīrusi maina saimniekšūnu centrālās oglekļa un lipīdu metabolismu.Mahon, KL un Parish, JL Ugunsgrēka infekcija ar vēzi: kā DNS audzēja vīrusi maina centrālo oglekļa un lipīdu metabolismu saimniekšūnās.Atvērtā bioloģija.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Šistosomu kateholestrogēni, aknu sēnītes un ar helmintu saistīts vēzis.priekšā.iekšā karsts.5, 444 (2014).